饲料中霉菌毒素检测及生物降解的方法
2霉菌毒素生物降解研究进展
霉菌毒素在地球上的存在年限甚至比人类的历史还要悠久,虽然其性质稳定,但并未因毒素的积累而造成灾害,故推断自然界本身存在可降解毒素的微生物或其它因素。由于霉菌毒素的毒性与其分子结构中相应的毒性基团有关;因此,只有将各类毒素分子结构中的毒性基团彻底破坏或消除并使之生成无毒的代谢产物,才能从真正意义上解除毒素对动物和人的危害。以下将对AF等主要毒素生物降解的研究进行综述,总结不同学者研究的效果和思路,综合考虑其实用性和应用价值,
2.1黄曲霉毒素生物降解的研究
在各类霉菌毒素中,AFB1的毒性和危害性最大,其分子结构中双呋喃环及氧杂萘邻酮环与其毒性及致癌性密切相关。国内外对AF生物降解的研究较早也较多,已发现许多真菌、细菌及其代谢产生的酶能够降解AF,目前也有关于植物提取物降解AF的报道。随着分子生物学及生物技术的发展,降解AF重组酶的研究将是未来的发展方向。
2.1.1真菌降解黄曲霉毒素
较早报道的能生物降解AF的真菌包括霉菌和食用真菌。霉菌有曲霉菌属(Aspergillussp.)中的黄曲霉、寄生曲霉和少根曲霉,及根霉菌属(Rhizopussp.)中的少根根霉、葡枝根霉等。孢霉(Dactyliumdendroide)和茎点霉菌属(Phomasp.)也能降解AFB1。报道的能降解AF的真菌酶包括食用真菌糙皮侧耳(Pleurotusostreatus)和假密环菌(Armillariellatabescens)产生的酶,及来源于白腐真菌(Trametesversicolor)的真菌漆酶等。
2.1.2细菌降解黄曲霉毒素
报道的能降解AF的细菌不多,有橙色黄杆菌(Flavobacteriumaurantiacum)、分支杆菌(Mycobacteriumfluoranthenivorans)、红串红球菌(Rhodococcuserythropolis)和芽孢杆菌(Bacillussp.)等,其解毒机理为酶解。中国农业大学动物营养国家重点实验室对AF生物降解进行了比较系统地研究,从动物粪便、发霉粮食、土壤等样品中得到199株细菌;再用AFB1复筛得到26株有降解活力的菌株;对其中降解活性大于75%的9株细菌进行了形态学观察和16SrDNA鉴定,这9株细菌分别为:嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)、橙红色黏球菌(Myxococcusfulvus)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、克雷伯氏菌(Klebsiellasp.)、短波单胞菌(Brevundimonassp.)、霍氏肠杆菌(Enterobacterhormaechei)、短状杆菌(Brachybacteriumsp.)、纤维菌(Cellulosimicrobiumsp.)和炭疽芽孢杆菌(Bacillusanthracis)。对其中解毒活性高的橙红色黏球菌的培养基和最佳发酵产酶条件进行了优化,在最佳发酵条件下黏球菌对AFB1的降解率达到80.7%。进一步研究表明,菌胞外代谢物不但可以降解AFB1,对黄曲霉毒素G1(aflatoxinG1,AFG1)和黄曲霉毒素M1(aflatoxinM1,AFM1)也有较高的降解活性。运用蛋白分离纯化技术对黏细菌黄曲霉毒素解毒酶(MADE)进行分离纯化,得到分子质量约为32kD的纯酶。研究表明,该酶在pH6、35℃时活性最佳。通过对比解毒酶处理前后质谱和红外光谱变化,推测其作用机理与AF中氧杂萘邻酮环的芳香内酯和甲氧基发生改变有关。MADE是目前国内外首先发现并有深入研究的能降解AF的细菌所产胞外酶。另外,筛选优化的枯草芽孢杆菌,发酵上清液降解AFB1达到80%、降解AFG1和AFM1分别为86%和52%;其发酵液还能显著抑制大肠杆菌、沙门氏菌以及金黄色葡萄球菌,并在胃肠道内可以抵抗胃酸和胆盐,有促进动物生产性能的作用。
2.1.3重组酶
关于重组酶生物降解AF的研究较少,目前仅有两种AF重组酶的相关报道。一种来源于白腐真菌的真菌漆酶,其在黑曲霉中表达的重组漆酶(118U•L-1)能降解55%的AFB1。另一种是来源于真菌假密环菌的黄曲霉毒素解毒酶(ADTZ)其在毕赤酵母中的重组酶(1.76U•g-1)仅降解25.52%的AFB1。尽管重组酶生物降解AF的研究少、解毒效率低,但其可提高酶的产量;因此,重组酶的研究始终是毒素生物降解未来的发展方向。
2.2单端孢霉烯族毒素、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素生物降解的研究
除AF生物降解的研究外,对污染粮食作物较为严重的单端孢霉烯族毒素、ZEN和OTA生物降解的研究也日趋得到重视。单端孢霉烯族毒素主要的毒性基团是C-12,13环氧环,其次是C-9,10位双键,乙酰基和羟基的位置和数量也与毒性有关。该类毒素的生物降解包括毒素分子的去环氧化、脱乙酰、羟化、水解和糖苷化。早期报道的能生物降解此类毒素的微生物多来源于动物消化道的混合物。随着研究技术的进步,近年来一些能降解该类毒素的单一菌株得到分离鉴定。 中国农业大学动物营养国家重点实验室与加拿大农业部食品研究所(AAFC,Canada)合作,从鲶鱼肠道内容物中分离筛选到能降解DON的细菌(Acinetobactersp.,Pseudomonaspoae,Leucobacteraridicollis,Empedobacterbrevis),其组成的混合物C133可将DON降解成DOM-1。从牛瘤胃液分离出的优杆菌(Eubacteriumsp.)能使DON转化成去环氧化合物DOM-1。Yu等用PCR-DGGE方法从鸡肠道中分离出能将降解DON的梭菌(clostridiales)、厌氧细杆菌(anaerofilum)、柯林斯氏菌(collinsella)和芽孢杆菌(bacillus)。ZEN是一类2,4-二羟基苯甲酸的内酯化合物,酯环开环可使其毒性去除。粉红黏帚霉(Gliocladiumroseum)和解毒毛孢酵母(Trichosporonmycotoxinivorans)可使ZEN开环生成无毒的非雌激素类化合物。最近报道,枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌也能降解ZEN。来源于粉红黏帚霉的内酯水解酶(lactonohydrolase)能使ZEN转化成非雌激素化合物而成为无害的代谢物排出体外。来源于恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)降解ZEN的解毒酶基因被克隆并成功转化到大肠杆菌中进行表达。OTA分子结构中苯丙氨酸基团是使母体化合物产生复杂毒力的基团,毒性基团被酶解破坏,其毒性可降低或去除。OTA生化降解途径有两种:①OTA酰胺键被水解成无毒的α-赭曲霉毒素(OTα)和L-β-苯丙氨酸;②推测OTA分子中的内酯环被水解开环,然而开环产物的毒性有待进一步确定。一些细菌、霉菌、酵母和丝状真菌能生物降解OTA。生物降解OTA的细菌有乙酸钙不动杆菌(Acinetobactercalcoaceticus)、乳杆菌(Lactobacillussp.)、枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌。霉菌有曲霉属、根霉菌、毛孢子菌属(Trichosporonsp.)等。酵母包括红酵母属(Rhodotorulasp.)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、解毒毛孢酵母;白腐真菌糙皮侧耳和黄孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)也能将OTA转化成OTα。研究表明,源于牛肝菌属(Bovinusbovis)的羧肽酶A(CPA)、酿酒酵母的羧肽酶Y(CPY)和黑曲霉的脂肪酶均能生化转化OTA。
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