如何利用现代微生物技术将生物质资源转化为蛋白质含量丰富、营养效价高的单细胞蛋白(SCP)饲料,解决资源紧缺和环境污染问题已经成为微生物领域的研究热点之一，尽管微生物混合发酵生产SCP仍面临很多问题,但作为一个生物混合体系,其中的微生物之间具有生长代谢协调作用,可以代替许多单菌发酵所不能进行的生产,因此微生物混合发酵应用将十分广泛。
1  单细胞蛋白
    单细胞蛋白又称微生物蛋白或菌体蛋白,是指酵母菌、非病源细菌、微型菌、真菌等单细胞生物体内所含的蛋白质。单细胞蛋白具有以下优点:蛋白丰富,营养效价高;生产原料来源广泛,价格低廉;工艺简单、稳定;生产周期短,效率高。
2  单细胞蛋白制取工艺
    国内外对SCP的制取主要集中于固态发酵工艺,即利用特定微生物对原材料纤维素、半纤维素、木质素等的降解能力,通过微生物的糖化发酵,达到产生大量菌体蛋白的目的。目前,在相关研究中,大多采用双菌种混合发酵,该方法的核心是选取分解纤维素和半纤维素能力较强的霉菌和酵母菌同时糖化发酵。在发酵过程中,霉菌、酵母共生,霉菌通过对纤维素的糖化为酵母提供碳源,酵母通过消耗还原糖解除其对霉菌生长的产物抑制作用。
3  微生物混合发酵
    混合发酵(MixedFermentation)一般指2种或2种以上的微生物发酵,是纯种发酵技术的新发展,也是一种不需要进行复杂的DNA体外重组,却可取得类似效果的新型发酵技术。如最常见的利用纤维素进行发酵,其底物常采用自然界中存在的纤维素类物质,如玉米秸秆、糠类、酒糟等废弃物,产物一般为饲料蛋白、食品和一些化合物。混合发酵中涉及到的微生物组成种类繁多,可以是细菌与细菌、细菌与真菌、真菌与真菌等几种组合方式,这几种组合方式的应用方向大致相同,主要是利用微生物降解环境污染物,从而生产单细胞蛋白。
3.1  微生物混合发酵的特点
3.1.1  酶系互补协作  某些微生物具有对某种底物的特异降解能力,但却缺乏对其他某些物质的降解能力,若能根据具体情况,对已明确的微生物进行必要的组合,使其和谐共存、协同作用,则可大大提高工作效率。李海红等利用从牛胃中分离到的真菌发酵玉米秸秆,发现在单菌种发酵中,绿色木霉的降解效果明显好于白腐菌和曲霉的降解效果,但三者结合使用的降解效果比单纯使用绿色木霉的高16%,原因是白腐菌能分解秸秆中的木质素成分,为木霉和曲霉对纤维素的降解提供了便利。
    Glancer研究发现,选用P.stipitis和T.penicillatum混合发酵可将玉米秸秆的稀酸水解物转化为菌体蛋白,而选用P.tannophilus和T.fermentaus亦可产生类似的效果,在该体系中,P.stipitis和P.tannopHilus均可将木糖发酵成乙醇,而T.penicillatum和T.fermentaus则以乙醇为碳源。
3.1.2  降低酶的反馈抑制  在通常情况下, 混合发酵比单一纯种培养发酵更快、更彻底。这其中的一个重要原因是在多菌发酵过程中,由于不同微生物对代谢途径中不同物质的及时利用有效地降低了底物的反馈抑制作用。司美茹等通过研究假丝酵母对黑曲霉和烟曲霉固态发酵中纤维素酶及淀粉酶活性的影响,结果表明:接入少量假丝酵母可大幅度提高曲霉菌纤维素酶体系中滤纸酶(FPA)、羧甲基纤维素酶(CMCase)、微晶纤维素酶(AVI)及淀粉酶的活性,这可能是酵母菌利用了水解形成的纤维二糖等小分子还原糖,从而解除了纤维二糖对纤维素酶和淀粉酶合成的阻遏,进而提高发酵产物的酶活性。
3.1.3  菌种互利共生  蒲一涛等 将固氮菌(Azotobac tersp.)和纤维素分解菌(TrichodermapseudokoningiRifi)进行混合发酵,结果表明:这2种菌的生长和固氮菌的固氮作用均高于各自单独培养,这与固氮菌在土壤中固氮能力比纯培养条件下高的实际情况相吻合。其原因是固氮菌除了能固定大气中的氮素外,还能形成维生素和异生长素,不仅能刺激农作物生长发育,而且能加强其它根际微生物的生命活动。
3.2  微生物混合发酵注意事项
3.2.1 菌种组合 混合发酵菌种组合常选择包括纤维素分解菌、木质素分解菌、蛋白增加菌等。产纤维素酶菌株多选用木霉,也可用曲霉、烟曲霉、黑曲霉或宇佐美曲霉等;木质素分解菌主要有侧孢霉、白腐菌等;常用酵母菌可提高蛋白含量,如产朊假丝酵母、热带假丝酵母、啤酒酵母等。菌种搭配时应注意菌株之间的相容性,尽量选用习性接近的微生物菌种。
3.2.2  发酵条件  发酵过程中的温度、时间、水分、pH等因素及其交互作用对发酵影响显著。对固态发酵而言,温度是首要因素。因此,首先必须根据所采用的菌种组合及原料的特点调整好培养基的起始pH、含水量;其次,需根据微生物的最佳生长繁殖温度设定好培养温度;最后,需明确微生物产生目标代谢产物的最佳时间,并根据实际情况确定发酵时间。
3.2.3  发酵料处理  由于一般混合发酵采用的原料多为纤维素类生物质资源,因此,在发酵前有必要对原材料进行充分的物理、化学处理,从而达到将纤维素、半纤维素、木质素等分离,使后续的酶解反应更顺利。通常采用的处理方法包括蒸煮法、酸/碱处理法、有机溶剂处理法、生物法和湿氧化法等。另外,秸秆材料中的营养成分并不能完全满足微生物生长繁殖的需要,因此还要添加适当的碳源(如麸皮等)和氮源(如尿素等),以便提高产物的酶活力和蛋白含量。对于好氧性较强的微生物,添加适量的膨胀剂(如膨润土等)也是必要的。
4  微生物混合发酵产SCP研究进展
    目前,对微生物混合发酵生产SCP的研究主要集中在高效菌种的筛选及改良、发酵工艺的优化改进以及寻找合适原材料方面。
4.1  高效菌种的筛选及改良  目前, 人类对于微生物的认识还十分有限,一方面是受限于有限的技术条件,另一方面是由于微生物资源种类繁多且分布广泛。基于微生物资源的丰富性,研究者极有可能从自然界中筛选到适合发酵和生产SCP的高效微生物菌株。因此,大量针对合适菌株的筛选工作也随之展开,并且取得了良好效果。
    Banat等从科威特分离筛选出一种嗜热芽孢杆菌Ba cillussp.(KISRITMIA,NCIMB40040),该菌在实验室中经过优化的工艺处理后,能使SCP产率达到5.06g/(L h)。
    Gustavo等介绍了一种通过基因工程技术改良了的酵母菌   Kluyveromycesmarxianus,该菌在生产 -半乳糖苷酶、 -葡萄糖苷酶、单细胞蛋白等活性物质方面具有潜在的优势。国内在这方面也有相关的研究,涂璇等通过紫外线诱变选育出的纤维素酶高产突变株黑曲霉和烟曲霉(UA8Aspergillusfumigatus和UF2Asper gillusniger)与酵母菌混合发酵,在短时间内可大大提高纤维素酶组分的活性,这为进一步利用微生物发酵纤维素含量较高的秸秆类资源、农作物壳类资源生产SCP提供依据。
4.2  发酵工艺的优化与改进  由于通过现代生物技术筛选改良适合生产SCP的菌种的成本较高,不确定因素也较多,且筛选出的菌种性状稳定性差。因此,目前对于利用微生物发酵生产SCP的研究更多集中于利用各种方法对其生产工艺的优化与改进。Gao等通过对培养基进行优化,经过56h的发酵,发现每1L培养基中可产生10.1g的marineyeastCryptococcusaureusG7a菌体细胞干重。Tipparat等在利用Schwanniomycescastellii发酵生产SCP时,通过改变发酵工艺,大大提高了该菌对淀粉的转化能力。
4.3  寻找合适的原料  在具备优良菌株及良好工艺的条件下,还必须找到合适的原材料。原材料必须具备以下几个首要条件,如价格低、取材易、数量多、糖类物质含量丰富等。目前,国内外对原材料的研究主要集中于玉米芯、水稻秸秆、工业废水、废渣等。这些材料一方面造成了资源的浪费,另一方面也给环境造成了严重的污染。
    Rajoka、Matilda、廖雪义、肖佐华等的相关研究已证明米糠、多年生草、小麦酒糟、玉米秸秆、水稻秸秆等是良好的SCP生产原材料。随着生物技术特别是微生物技术的发展,将有更多的材料变废为宝。