食品和饲料中动物源性成分检测技术
2 基于DNA 序列特异性的鉴别技术
DNA分子是大多数生命体最核心的遗传信息储存单元，在细胞中大量存在，主要分布于细胞核和线粒体、叶绿体等一些细胞器中。与蛋白质分子相比，DNA分子除了具有种内保守性高，种间特异性强的优点外还具有较高的热稳定性，而且其核苷酸序列不会受到环境和加工条件影响而改变，可独立用于物种判别依据。因此，利用DNA分子序列特异性开发定性、定量检测食品、饲料中动物源性成分的方法和技术定已成为该领域的研究焦点和主流，也是多数国家检测方法标准中指定的检测方法。
2.1 DNA 杂交技术
DNA杂交技术是PCR技术出现之前基于DNA序列特征识别动物源性鉴别技术的主要类别，其原理是根据碱基互补配对原理，利用标记有荧光素、生物素或放射性同位素等信号分子的特定DNA片段(探针)识别其互补序列DNA分子的技术，根据信号有无或强弱判断样品成分类别或多少。Ebbehoj和Thomsen等应用32P-标记探针建立了检测生、熟牛肉中猪肉成分的DNA杂交技术，同年开发了能够区分近亲物种成分(猴和人、牛和绵羊或山羊)的条形-斑点杂交技术，检出限根据检测对象亲缘关系的远近分布在0.01%～10%区间。随后出现了大量类似的方法，可鉴别成分涵盖了猪、牛、羊、鸡、马等主要动物种类。用于探针设计的靶序列通常为基因组DNA、卫星DNA等，表2列出了相关研究的统计信息。
由于该方法没有经过PCR扩增灵敏度要低于PCR法，逐渐被PCR法替代，但近年来随着芯片技术的发展DNA杂交结合PCR技术在高通量筛查技术中找到了新的舞台。石丰运等建立了能同时检测牛、山羊、猪、鸡4种动物成分的基因芯片法，能实现一次反应完成对多种动物源性成分的种类初筛和鉴定。深圳检验检疫局开发了能同时检测牛、羊、马、猪、鸡、鸭、鸽等16种动物源性成分的基因芯片技术，大大提高了筛查和成分鉴定效率。
2.2 基于PCR 的动物源性成分检测技术
聚合酶链式反应(PCR)技术最早由Mullis等于1986年提出，理论上能够将样品中单拷贝的DNA片段进行指数倍扩增，将其应用于动物源性成分检测技术后，极大地提升了检测灵敏度和结果可靠性。无论是普通PCR还是实时荧光PCR法，其核心内容都是引物和探针的设计与制备，引物和探针体系的好坏决定了方法的优劣。
线粒体DNA具有细胞内拷贝量大、物种内保守性高和物种间特异性强的优点，常被用于扩增靶序列进行引物设计，如表3～6，细胞色素b(cytochromeb)、12SrRNA、ATP酶亚基6(mitochondrialATPasesub.6)、ATP酶亚基8(mitochondrialATPasesub.8)、细胞色素c氧化酶亚基1(COX1)等都有应用。
2.2.1 PCR- 电泳
用物种间高异性引物对样品中的DNA进行PCR扩增后琼脂糖电泳分离，通过观察是否有特异性条带出现便可判定样品中是否含有相应的物种成分。该方法灵敏、便捷、准确，而且成本低廉，大量的具体方法和技术已被建立和开发，实现了对常见动物源性成分(单一或混合物)的快速检测，详见表3。该法只适合定性检测，也可利用凝胶成像系统完成半定量分析，但无法实现样品中特定成分含量的精确测定。
2.2.2 PCR-RFLP
限制性片段长度多态性(restrictionfragmentlengthpolymorphism，RFLP)是应用物种间同源基因上特定限制性内切酶位点特异性来实现对样品中动物源性成分来源的识别。此方法简单高效，无需设计物种特异性引物，使用适合的通用引物即可，将扩增产物进行限制内切酶反应，通过分析电泳图谱特征来判定物种来源，但该方法适合鉴别单一成分样品，多物种混合物样品由于电泳图谱较为复杂，分析难度较高，结果可靠性较低。高琳等建立了以动物线粒体DNA中Cytb区段保守序列为靶序列的PCR-RFLP肉种检测方法，能从猪、牛、羊、鸡、鸭、兔6种生肉及高压猪肉、猪肉火腿肠等7种热加工肉制品中鉴别出猪源性和牛源性成分。Rea等同样以Cytb为分析对象建立了能鉴别鱼酱制品中欧洲鳀、黍鲱、沙丁鱼单独或混合DNA成分的PCR-RFLP法。Wang等进一步扩展了PCR-RFLP的应用，将其和荧光标记技术结合建立了能够检测猪、牛、羊等12种肉种成分的T-RFLP技术，丰富了食品中DNA成分来源鉴定的筛查技术，该技术特点是将12SrRNA通用上游引物5＇端标记上FAM染料，下游通用引物5＇端标标记HEX染料，配合AluI和Tru9I两种限制性内切酶，通过荧光和条带长度双重信号判定结果，提高了RFLP法的灵敏度和准确性，并提供了快速鉴定食品中DNA成分来源的新途径。表4列出了其他一些类似方法的统计信息。
2.2.3 PCR 测序
该方法是将特异性PCR反应得到的扩增产物分离纯化后进行测序，并到基因组数据库进行序列比对来确定待检样品所属的物种类型，例如，Iijima等建立了基于18SrRNA基因测序的食品中动植物源性成分来源分析方法，Girish等建立了基于线粒体12SrRNA基因测序的鉴定方法。我国国家标准“饲料中牛羊源性成分的定性PCR法(GB/T20190—2006《饲料中牛羊源性成分的定性检测》)”也采用的是PCR测序方法(表6)。理论上该法准确、可靠，是理想的定性检测方法，但须经过分离、纯化和测序的步骤，过程繁琐限制了该方法的应用，随着测序技术的快速发展其价值也在逐步显现。
2.2.4 随机引物的扩增
随机引物的扩增法(randomamplifiedpolymorphicDNA-PCR，RAPD)使用非特异性引物，能与模板上多个位点结合而不是与某一限制性位点特异性结合，经过PCR扩增反应后可产生多个PCR产物，最有效结合的引物在扩增过程中相互竞争而产生指纹，经过凝胶电泳可产生物种特异性的图谱，以此来鉴定样品中的动物源性成。Saez等建立了能够鉴别猪、牛、羊、鸡和火鸡的随机引物扩增指纹图谱技术，Cushwa等对RAPD在物种鉴定中的应用做了详细的综述。RAPD的优点在于无需知道分析对象的全基因组序列，但其局限性也很突出，如只适合分析单一成分样品，而对分析多成分混合物会有一定困难。
2.2.5 实时荧光PCR
实时荧光PCR技术(real-timefluorescentpolymerasechainreaction，RT-PCR)是一种在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个反应进程的PCR技术，并可通过标准曲线对未知模板进行定量分析。该技术的出现使物种鉴别的灵敏性和准确性都有所提高，而且该技术无需进行电泳过程，避免了溴化乙锭等有毒染料的使用，降低了实验对人体的危险系数。
其更大优势在于可通过设立外标物制作标准曲线实现对样品中特定动物源性成分(DNA)含量的绝对定量，通过分别加入特异性引物和通用引物实现特定成分的相对定量，从而实现对肉类食品中掺假成分含量的测定和掺假行为严重程度的判定。其缺点是检测成本较高，包括仪器和实验耗材。
荧光监测模式一般分为SYBRGreenI模式、水解探针模式、杂交探针模式3种，SYBRGreenI是一种只能与双链DNA结合而无法与单链DNA结合的荧光燃料，与双链DNA结合后荧光增强1000倍，SYBRGreenI的荧光信号强度与双链DNA的数量相关，可以根据荧光信号检测出PCR体系存在的双链DNA数量。Walker等开发了针对卫星DNA和SINE特异性设计的能从未经加热处理的混合DNA样品中定量检出反刍动物、牛、猪和鸡源性成分的SYBRGreenⅠ荧光定量检测方法，Fajardo等随后针对12SrRNA特异性开发了类似方法，详见表5。SYBRGreenI模式的优点是无需制备探针，成本低，通用性好。但该模式对PCR反应中的非特异性扩增或引物二聚体也会产生荧光，造成本体较高，假阳性结果产生几率较大。为了解决此问题，张慧霞等尝试用将溶解曲线分析引入到SYBRGreenⅠ实时荧光PCR检测技术中，成功实现了混合物样品中鹌鹑成分的检出，在特异性和成本上找到了较好的平衡。
TaqMan探针法是水解探针模式的一种，引入了5＇端和3＇端分别标记荧光报告基团和淬灭基团的探针，通过Taq酶5＇端外切酶活性释放荧光信号，只有当样品中含有扩增目的基因，并启动扩增过程后荧光信号才会出现并逐渐积累，其信号强度与扩增出目的DNA片段有着紧密的正相关关系。与靶基因模板序列互补探针加强了信号特异性，使得TaqMan探针法在特异性上具有无以比拟的优势，是目前使用较多的方法类型。Rodríguez等建立起了混合肉样中猪肉成定量检测的TaqMan方法。
该方法基于线粒体12SrRNA基因序列设计了猪特异性引物和哺乳动物通用引物，两套引物、探针位于相近位置，极大降低了由于扩增效率和加工过程中基因断裂产生的系统误差，但其扩增产物片段长度为425～428bp，不利于检测热加工后的样品。Zhang等采用类似的设计理念，基于线粒体中细胞色素b，建立了能够定量检出鲜肉、熟肉制品、乳和乳酪中牛源性DNA的TaqMan方法，其扩增产物片段长度仅为133bp，能检出35pg级的牛源性DNA，且无交叉反应。
TaqMan探针法的缺点在检测成本高和由于荧光淬灭不彻底导致的本底偏高，而新型的TaqMan探针——“MGB探针”有效解决了这一问题，使本底信号大大降低，Tanabe等据此建立了能够检出10ng/μL小麦线粒体DNA中100fg/μL的猪、鸡、羊、马肉DNA成分的方法，线性拟合度在0.994～0.999之间。
Abdulmawjood等将反转录技术与MGB探针技术结合，建立了样品中胶质纤维酸性蛋白(GFAP)这一中枢神经特异性标志物的mRNA的RT-PCR检测法，实现了对样品牛中枢神经系统成分(CNS)的定向检测，该方法具有很好的特异性，与心、肝、肺等非中枢神经组织均无交叉反应，检出限为0.01%而且不会受到加热工艺的影响。
杂交探针模式包括FRET双杂交探针法、分子信标法等和属于第3代荧光探针技术的Amplifluor法、LUX法等，也是适应荧光PCR常见的技术类型，但在食品和饲料中动物源性DNA检测技术领域中还鲜有文献报道。
实时荧光法的另一优势在于可通过标记不同的荧光基团(FAM、TET、VIC、HEX等)，实现多重PCR反应多通道同步实时检测，大大提高了检测通量和效率。
虽然该技术试剂成本较高，不适于现场快速检测，但由于其在灵敏度、准确性和重复性等重要性能参数上无可比拟的优势，仍是该领域的研究热点和趋势，是作为仲裁方法和司法鉴定的理想技术类型，是现行国家和行业标准中指定的方法之一。
2.3环介导等温扩增技术
环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)是一种崭新的DNA扩增方法，与普通PCR相比其最大的特点是利用具有链置换活性的DNA聚合酶(如BacillusstearothermophilusDNApolymerase)在65℃对样品中DNA进行等温扩增，而无需进行温度变化循环，具有简单、快速、特异性强的特点。Ahmed等开发出了基于环介导基因恒温扩增(LAMP)和电化学芯片技术联用的动物源性成分生物传感鉴定技术(图1)
，分别能检出混合样品中20.33ng/μL的猪肉成分，20.33ng/μL的鸡肉成分，以及78.68pg/μL的牛肉成分。该技术为肉种鉴别技术小型化、便携化合自动化开辟了新的途径。LAMP法也有局限性，由于是链置换合成，不适合进行长链DNA的扩增，在产物回收鉴定、克隆、单链分离方面的表现也不如传统PCR。准，由于动物DNA组的复杂性，单纯PCR产物分析较容易产生假阳性结果，因此为了提高检测结果的准确性，标准中指定的方法通常在特异性PCR扩增结果后加上限制性内切酶验证或测序的步骤。由于TaqMan实时荧光PCR法中引入了特异性的探针分子大大增强了信号的特异性和结果准准确性。上述两种方法是我国现行标准的指定鉴定方法，详见表6。
但目前所指定的方法都是定性检测方法，还未涉及定量检测方法，定量检测方法还待进一步研究和建立。
