3 饲料中硝基呋喃类药物检测研究概况与进展
    文献报道有关硝基呋喃类残留的检测方法很多，主要有高效液相色谱法(HPLC)、超高压高效液相色谱法(UPLC)、液相色谱-质谱法、液相色谱-串联质谱法、免疫分析法、分光光度法等。
3.1 高效液相色谱法(HPLC)
    高效液相色谱法(HPLC)在硝基呋喃类抗生素的检测中比较常见，HPLC法所用的检测器文献报道较多的有紫外检测器(UV)，二极管阵列检测器(DAD)和电化学检测器(ECD)。
3.1.1 液相色谱- 紫外检测器(LC-UV) 在硝基呋喃类抗生素原药化合物的检测中高效液相色谱应用最多，而高效液相色谱最常用的检测器就是紫外检测器(UV)。配合使用固相萃取(SPE)前处理净化技术，高效液相色谱(配有紫外检测器)法快速测定鸡肉、鱼、虾中呋喃它酮、呋喃西林、呋喃妥因、呋喃唑酮药物残留量，4种硝基呋喃类药物在鸡肉、鱼、虾样品中3个不同水平的添加回收率为87%～102%；相对标准偏差(RSD)为2.0%～7.8%；工作曲线的线性范围为5μg/kg～100μg/kg；呋喃它酮、

 呋喃西林、呋喃妥因、呋喃唑酮的检出限分别为5μg/kg、2μg/kg、3μg/kg、2μg/kg。另有文献报道利用高效液相色谱法(配有紫外检测器)测定水产品中呋喃唑酮的残留量，其方法灵敏度高，检测限为1.0μg/kg。
3.1.2 液相色谱- 电化学检测器( L C - E C D )
    电化学检测器( E C D ) 因其高灵敏性也在硝基呋喃类抗生素的检测中得到应用。利用HPLC-ECD来检测牛奶中的呋喃妥因、呋喃唑酮和呋喃它酮，检测限分别为5ng/mL、4ng/mL、4ng/mL。在4ng/mL、10ng/mL、25ng/mL的添加回收率分别为85%～97%、87%～97%、83%～98%。利用改进的HPLC/ELCD高效液相色谱电化学检测器检测鸡组织和鸡蛋中的呋喃唑酮和盐酸呋喃它酮，其回收率为80.0%～99.0%；呋喃唑酮的检测限为1ng/g，盐酸呋喃它酮的检测限为2ng/g。
3.2 联用技术分析法
    色谱技术广泛应用于多组分混合物的分离和分析，特别适合有机化合物的定量分析，但定性较困难；质谱仪只能够对单一组分提供高灵敏度和特征的质谱图，但对复杂化合物分析无能为力。将色谱和质谱技术进行联用，对混合物中微量或痕量组分的定性和定量分析具有重要意义。由于硝基呋喃类抗生素对光敏感，具有代谢快速的特点，在动物体内的半衰期不过数小时，通常在饲料或者动物性食品中硝基呋喃类抗生素及其代谢产物往往同时存在，利用色谱和质谱联用技术将大大提高分析的灵敏度、特异性和准确性。
    对硝基呋喃类代谢物残留的分析，因其低的质量和微弱的紫外吸收特性使分析检测变得困难。因此为了诱导分子紫外吸收，通常将代谢物用2-硝基苯甲醛(2-nitorbenzaldehyde，2-NAB)进行衍生化，以使其代谢物能被液相色谱紫外检测器检测到。硝基呋喃代谢产物(AOZ，AMOZ，SEM，AHD)可在酸性条件下被水解，可同时用2硝基苯甲醛(2-nitrobenzaldehyde，2-NBA)衍生化。
3.2.1 液相色谱- 质谱法(LC-MS)
    应用HPLCDAD(光二极管阵列检测器)检测鸡蛋中硝基呋喃类药物残留并用HPLC-MS进行确认。呋喃西林、呋喃唑酮、呋喃它酮利用HPLC-MS方法检测限分别为3.2μg/kg、1.6μg/kg、1.0μg/kg。可见LC-MS是一种灵敏度高、选择性好、特异性强、快速的分析确证硝基呋喃类药物残留的方法。但是其仪器设备的购置和运行费用较高,成为常规分析方法尚有一定困难。
3.2.2 液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)
    最近几年用于检测硝基呋喃类抗生素的代谢物的LC-MS/MS方法发展迅速，它是一种灵敏度更高、选择性更好、特异性更强的方法，目前许多国家已将LC-MS/MS方法作为检测硝基呋喃类抗生素代谢物的确证性方法。采用电喷雾电离(ESI)，选择反应监测(SRM)模式、三离子原则、外标法定量，建立了硝基呋喃代谢物多残留检测方法，定量限为0.1ng/g～0.5ng/g,检测限为0.5ng/g～0.1ng/g。另有文献报道依次用甲醇、乙醇和乙醚溶剂提取，使动物源性样品中4种硝基呋喃类游离态代谢物进入提取液，而结合态代谢物保留在残渣中，在酸性条件下用2-硝基苯甲醛分别衍生游离态和结合态代谢物，经乙酸乙酯提取浓缩后，用液相色谱-四极杆串联质谱仪定性，同位素内标法定量，回收率为85.2%～112.5%，检出限均为0.3μg/kg。也有对动物组织中4种硝基呋喃类代谢产物AMOZ、AHD、SEM、AOZ的同位素稀释HPLC-MS/MS线性组合分析方法，以2-基苯甲醛作为衍生化试剂，AMOZ-d5、AOZ-4作内标，用乙酸乙脂提取，用自制的净化试剂净化，以乙腈-0.1%甲酸为流动相，采用梯度洗脱，可适应不同种类的动物组织样品前处理，15min可将4种代谢产物完全分离并测定。提出了HPLC-MS/MS多重反应监测线性组合法的原理并进行了验证，回收率为85%～118%；定量限(LOQ)为0.1μg/kg；检出限(LOD)为0.03μg/kg。蜂蜜及水产品中四种硝基呋喃代谢物多残留的LC-MS/MS方法，AOZ检出限为0.02ng/g。鸡蛋中呋喃唑酮代谢物的残留测定方法，AOZ线性范围0.05μg/L～5.00μg/L，最低检测限为0.05μg/L。
3.3 超高效液相色谱法(UPLC)
    超高效液相色谱是一个新兴的领域，作为世界第一个商品化UPLC产品的WatersACQUITYUPLCTM超高效液相色谱系统也是刚刚出现。与传统的HPLC相比，UPLC的速度、灵敏度及分离度分别是HPLC的9倍、3倍及1.7倍。因此其在蛋白质、多肽、代谢组学分析及其它一些生化领域里将会得到广泛应用。另外，在天然产物的分析方面，使用UPLC与质谱检测器连接，会对天然产物分析，特别是中药研究领域的发展是一个极大的促进。应用超高效液相色谱(UPLC)同步检测饲料中3种硝基呋喃类药物，采用微波萃取方法提取样品中的呋喃西林、呋喃妥因和呋喃唑酮，提取溶剂为乙腈，提取条件为80℃下微波萃取10min；用OasisTMMCX小柱净化，流动相为0.3%的冰醋酸溶液：乙腈(体积比)=90∶10，流速为0.4mL/min，进样量为5μL。
    在上述试验条件下，呋喃西林、呋喃妥因和呋喃唑酮的保留时间分别为1.69min、1.99min和2.40min，检出限分别为0.01μg/mL、0.015μg/mL、0.01μg/mL，平均回收率分别为84.6%～92.3%、80.0%～92.3%、83.8%～92.3%，在0.05μg/mL～10μg/mL范围内有良好的线性关系。该方法简便、省时、灵敏度高，可同时测定饲料中呋喃西林、呋喃妥因和呋喃唑酮的含量。
3.4 免疫分析法(IA)
    酶联免疫分析法(ELISA)是最为常用的方法，此方法的优点是灵敏度高、操作简便、检测迅速;缺点是仍不能实现在线检测，而且假阳性率较高。目前已经建立了呋喃唑酮间接竞争ELISA检测法，将呋喃唑酮与牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HAS)联接，分别作为免疫原及包被原，并建立了水产养殖动物组织中呋喃唑酮的ELISA筛选方法，测定的最适范围为10ng/mL～100ng/mL，最小检测限为1ng/mL。
    ELISA方法的孔间差异为4.16%，板间差异为9.20%，试验重复性好，添加回收率试验测得虾肉样本平均回收率为94%,在试验浓度范围内，呋喃唑酮的抗血清与呋喃西林的交叉反应性为43%，与其它药物未显示免疫交叉反应性。应用进口的呋喃唑酮试剂盒检测呋喃唑酮及其代谢物AOZ，平均检测下限约为50ng/kg。
    根据样品的前处理情况，可以得出样品的检测下限为100ng/kg，禽肉的回收率大约为80%～90%。该试剂盒特异性强，但仍无法同时一次性检测多个硝基呋喃类代谢物残留。
    目前国外已有呋喃唑酮、呋喃它酮代谢物商品化的试剂盒开发出来,而我国只能靠引进国外的试剂盒,现在各商检部门所使用的和各生化试剂公司出售的都是德国r-Biopharm公司生产的试剂盒,其价格昂贵。
3.5 分光光度法
    分光光度法主要是用来测定动物饲料中呋喃唑酮等硝基呋喃类药物添加剂。利用分光光度法测定饲料中的呋喃唑酮，这种方法是将饲料试样中的呋喃唑酮用二甲基甲酰胺(DMF)提取出来，使其与苯肼盐酸溶液反应，产生亮黄色的反应物，再用甲苯萃取后，在440nm处用分光光度计读取其吸光值，从而进行测定。此方法测定简便，线性相关系数r≥0.9995,试样回收率在95%～102%之间。此方法操作简单，不需要昂贵的仪器，且可以判定动物性产品中是否存在硝基呋喃类药物，因而在设备不完善的部门有一定的推广价值。但是灵敏度较低，不能作为确证的方法，在实际生产中应用很少。

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