中国转基因在棉花领域研发应用的二十年
1.3抗除草剂转基因棉花
草害是影响棉花生产的主要因素之一,棉田杂草种类严重影响棉花的生长。除草剂和抗除草剂棉花的协同使用是棉田杂草防除的重要对策。目前,抗除草剂主要有2种策略:一是引入降解除草剂的酶或酶系统,在除草剂发生作用前将其分解。二是修饰除草剂作用的靶蛋白,使其对除草剂不敏感或促使其过量表达以使作物吸收除草剂后仍能正常代谢。中国科学家针对这两种策略均做了大量研究。
1.3.1抗草甘膦
草甘膦是世界上使用最广泛的一种非选择性内吸传导有机膦类除草剂。其机理是竞争性抑制植株中5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPs)的活性,阻断芳香族氨基酸的合成,造成芳香族氨基酸缺乏,导致植株死亡。国内对抗草甘膦的基因进行了大量研究,取得了很多可喜的进展。
雷凯健等2006年从土壤总DNA中克隆到草甘膦N-乙酸转移酶基因,并对其表达蛋白的酶学特性进行了分析,为其在抗草甘膦转基因作物中的应用积累了理论依据。何鸣等通过对鼠伤寒沙门氏杆菌和大肠杆菌的EPSP合成酶基因多位点突变,克隆了突变的aroA,并使之在大肠杆菌中得到表达。赵特从严重草甘膦污染的土壤中分离出一株高抗草甘膦的假单胞杆菌菌株,克隆到与EPSPS同源的G6基因,将其转化水稻进行功能验证,发现该基因具有一定的抗草甘膦活性。朱玉从长期污染草甘膦的土壤中分离到一株草甘膦高耐受性荧光假单胞菌G2菌株,从中克隆到的epsps不含国外公司专利保护的保守序列和突变位点,显示了良好的开发应用潜力。沙纪莹从斯氏假单胞菌基因组文库中克隆到一个完整的基因,能在草甘膦浓度为150mmol·L-1的M9液体培养基中良好生长,该基因有望成为培育高抗草甘膦转基因作物的基因材料。刘柱从被草甘膦极度污染的土壤中分离到一株极端抗草甘膦菌HTG7,该菌株能在草甘膦浓度为900mmol·L-1的Mops限制性培养基上生长。从中克隆到全长1350bp、编码EPSP合酶的基因。该EPSP合酶基因与之前报道的aroA在核苷酸水平几乎没有任何同源性,蛋白序列与22种已报道的微生物来源的EPSP合酶的同源性也在46%以下。并通过错误倾向PCR方法,找到了该EPSP合酶的关键活性位点,为培育具有中国自主产权的转基因抗草甘膦作物提供的基因资源。童旭宏等从陆地棉中克隆到EPSPS,对该基因进行了组织特异性表达分析,为抗草甘膦棉花种质资源的创制提供了理论基础。程海刚等从棉田间的杂草青麻中克隆到epsps,通过转化酵母证明所获得的epsps具有生物学功能。之后,中国农业科学院生物技术研究所郭三堆课题组将该基因转化棉花,筛选出具有良好草甘膦抗性的棉花植株。此外郭三堆课题组还和中国农业科学院生物技术研究所林敏课题组合作,将林敏课题组从极端抗草甘膦微生物中克隆到的抗草甘膦新型EPSP合酶GR79及N-乙酰转移酶GAT进行了密码子改造和基因结构优化,通过转化烟草和棉花,初步验证了抗草甘膦基因的抗性,并获得了对草甘膦有较强抗性的双价抗草甘膦转基因棉花材料。
1.3.2抗其他除草剂
除草剂2,4-D类似植物生长素,前人从土壤细菌Alcaligeneeutrophus分离到tfda,该基因编码的2,4-D单氧化酶能将2,4-D降解为2,4-二氧苯酚,其降解产物对植物的毒性比2,4-D小100倍,山西省棉花研究所陈志贤等与澳大利亚CSIRO及中国农业科学院生物技术中心合作,将tfda导入晋棉7号、冀合321等棉花品种,对其后代进行田间抗药性鉴定表明转基因系对2,4-D的耐受性超过了大田使用浓度。中国农业科学院棉花研究所与中国科学院上海植物生理研究所合作,将除草剂草丁膦的bar导入棉花主栽品种,取得了阶段性成果。张磊通过精细定位,从水稻中克隆到bel,该基因可对苯达松和磺酰脲类除草剂产生抗性。溴苯腈是除草剂buctril的活性成分,其作用机理是抑制光合作用的电子传递。张金文等2006年从克雷伯氏臭鼻杆菌中克隆到编码腈水解酶基因bxn,通过在大肠杆菌中表达,证明其可将溴苯腈降解为无毒物质。乙酰乳酸合成酶(ALS,EC2.2.1.6)在细菌、酵母和植物中催化支链氨基酸的生物合成,它是磺酰脲类除草剂的作用靶标。宋贵生等2007年从水稻中克隆了als,转化烟草后发现转基因植株和对照烟草相比其除草剂抗性高达50mg·L-1。卢宗志等2009年从杂草雨久花中克隆到als,研究表明抗药性雨久花对除草剂苄嘧磺的抗性可能与其第197位的突变相关。
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