天蚕素抗菌肽CAD 在畜牧生产中的应用

2 天蚕素抗菌肽CAD
2.1 天蚕素抗菌肽
天蚕素抗菌肽(Cecropins) 属于阳离子抗菌肽家族中重要的一族，最早由瑞典科学家B o m a n  等于1980 年用阴沟通杆菌及大肠杆菌诱导惜古比天蚕(Hy a l o p h o r ac e c r o p i a ) 蛹后发现。天蚕素抗菌肽是世界上发现最早，也是研究最彻底、效果最明显的一类抗菌肽，是昆虫非特异性免疫系统的重要组成部分，一般由31 ～ 39 个氨基酸组成，分子量约为3.5k D a ～ 4k D a 左右，其分子结构相对保守，主要由α 螺旋构成，属于α 螺旋类抗菌肽。这类抗菌肽热稳定性好，无免疫原性，抗菌能力强，能有效抑制革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的生长。研究发现天蚕素抗菌肽对一些真核细胞不具毒性作用，如家蚕cecropin A 和cecropin B 能够抑制并杀死白色念珠菌，但对人体细胞株J u r k a t 没有毒性，即使在高浓度下，也不会使真核生物的红血球发生溶解破裂。这些结构和功能上的特性使天蚕素类抗菌肽成为抗菌肽应用和研究的重要对象。
2.1.1 天蚕素抗菌肽的构效关系 由于Cecropin 分子结构相对保守，一般为α 螺旋- 铰链-α 螺旋结构，N 末端双亲α 螺旋；C 末端疏水α 螺旋，这种N 末端双亲α螺旋结构对于天蚕素抗菌肽发挥作用非常重要。F u 和Srisailam 等研究表明，α 螺旋对抗菌肽的杀菌活性强弱起着重要作用，同时其杀菌能力的强弱还与杀菌过程中Cecropin 在脂质表面聚拢的浓度和分子方向有关。
2.1.2 天蚕素抗菌肽的作用机制 目前，对于Cecropins的抗菌机制尚无定论，但普遍认为是通过破坏质膜脂质机制造成，即其通过自身阳离子所携带的正电荷与带负电荷的细菌脂膜之间的电荷作用，插入其中扰乱磷脂双分子层结构，使细胞脂膜去极化并在表面形成孔洞，造成细菌细胞因内容物外泄而死亡。这一过程分为两个阶段：Cecropins 与脂膜之间的相互作用和Cecropins 对脂膜的破坏。Hiromi 等研究发现，不同的天蚕素类抗菌肽可能具有不同的破坏质膜机制。2.1.3 天蚕素抗菌肽杂合肽 为了寻找更高效低毒的抗菌肽，使通过改造后的天然抗菌肽分子更小、活性更高，同时减少对真核生物的毒性及降低生产成本，研究者通过互联网和计算机软件比较分析了大量有关抗菌肽的序列和空间结构，根据分析结果设计具有更好抗菌活性的抗菌肽分子，使这些重组基因抗菌肽与人工设计的抗菌肽具有活性更高、抗菌谱更广、热稳定性好、没有抗原性、没有溶血作用等特点。如Fink 等研究发现，将CecropinA 和Cecropin D 的序列片段用固相法化学合成的杂合肽CAD，其抗菌活性高于天然的Cecropins 类抗菌肽，且抗菌谱也有所增加。Wachinger 等研究发现，天蚕素和蜂毒素的杂合肽可以在亚毒性浓度下抑制艾滋病毒HI V -1的基因表达，从而减少HI V -1 的增殖。但由于人工固相合成价格昂贵，不能进入实用领域，因此，杂合肽作为一类潜在的新型抗菌肽需要进一步研究。目前，国内外学者已经在杂合肽的基因工程方面做了很多研究工作，为杂合肽的开发和应用奠定了良好的基础。
2.2 天蚕素抗菌肽CAD
2.2.1 天蚕素抗菌肽CAD 简介 天蚕素抗菌肽CAD(Cecropin A and D，CAD) 是对Cecropins 类抗菌肽改造过程中，通过氨基酸替换的方法，设计合成的由含正电荷较高的Cecropin A(1-11) 片段和疏水性较强的Cecropin D(12-37) 片段构成的杂合肽。CAD 由37 个氨基酸组成，分子量为3.8k D a，其二级结构中78.38% 为α 螺旋，其余为无规则卷曲。其中Cecropin A(1-11) 片段被认为能形成典型的α 螺旋结构。研究表明CAD对被测试的6 种细菌的抗菌活性分别为天蚕素D 抗菌活性的5 ～ 55 倍，与天蚕素A 相比，其抗菌活性也略高。在抗枯草芽孢杆菌上，CAD 的活性比天蚕素A 高6 倍左右，增加的活性源于C A D 在序列中部和羧基端同天蚕素D 具有相类似的结构，即比天蚕素A、B 更强的螺旋程度和羧基末端更强的疏水性。C A D 显著的特征是能够快速在人工膜上形成电压依赖型离子通道的能力。目前该杂合肽C A D 已由国家饲料工程技术研究中心通过基因工程方法在枯草杆菌表达载体中表达获得，表达产物活性高、理化特性好，且抗菌特性比目前国内外文献报导的具有优势。通过微生物发酵生产顺利解决了抗菌肽产品生产成本昂贵这一限制其广泛应用的瓶颈，在兽药和饲料添加剂领域具有广阔的应用前景。
2.2.2 由枯草芽孢杆菌作为C A D 表达系统的优势 用大肠杆菌作为表达载体会形成以不可溶状态内含体形式存在的紧凑型多肽分子，这种内含体蛋白是丧失生物学活性的，如果要恢复其部分活性需要经过复杂的溶解、再折叠和纯化过程。用酵母表达系统如毕赤酵母表达系统可以解决这些翻译后加工问题，但是随后的分批培养过程却需要耗费大量的成本，这使酵母表达系统作为抗菌肽的表达系统也不现实。枯草芽孢杆菌表达系统不会存在上述两种表达系统作为表达载体时出现的问题，特别是对异种蛋白的分泌上。由枯草芽孢杆菌表达的外源蛋白通常以具有生物活性的形式存在，且其下游的纯化过程被极大简化。该表达系统还有个优点，在这种理论上较高表达量的情况下，表达产物不会在表达系统内累积，为继续培养和生产提供了可能，进而极大的简化了目的蛋白的表达过程和降低生产成本。
2.2.3 天蚕素抗菌肽CAD 稳定性 伍小松 等对天蚕素抗菌肽C A D 热稳定性的研究结果表明，天蚕素类抗菌肽C A D 在37℃～ 55℃时具有较高活性，而人和畜禽的体温接近40℃，这满足其发挥活性的温度条件。此外，该产品耐热性和耐酸性效果较佳，在100℃水浴15mi n 后或pH为1 时仍表现出对金黄色葡萄球菌的抗性。在被胃蛋白酶和胰蛋白酶作用后，CAD 仍然具有活性。
2.2.4 天蚕素抗菌肽C A D 安全性 谯仕彦等( 资料未发表) 研究了天蚕素抗菌肽CAD 的安全性，结果表明：对大、小鼠经口急性毒性试验的LD50 ＞ 5000mg/kg 体重；小鼠精子畸形和骨髓细胞微核试验结果均为阴性；对大鼠无亚慢性毒性；无明显生殖毒性和胚胎毒性；无慢性毒性和致癌性。3 天蚕素抗菌肽CAD 在畜牧生产中的应用
3.1 对大鼠生长性能和免疫功能的影响
    陈香 等研究表明在大鼠日粮中添加75mg/kg 的天蚕素抗菌肽，可提高大鼠平均日增重和日采食量，并可降低料肉比。在试验第14d 时，抗菌肽促进小鼠脾脏和胸腺的生长发育，脾脏指数和胸腺指数是机体脾脏和胸腺发育程度的一个重要反映，说明天蚕素抗菌肽具有增强机体免疫功能。王阿荣 等也发现，日粮中添加天蚕素抗菌肽能提高断奶仔猪的机体免疫性能。
3.2 对猪生长性能的影响
    陈香 等研究发现，在断奶仔猪日粮中用250m g /kg 的天蚕素抗菌肽CAD 替代10% 的硫酸抗敌素300mg/k g 和10% 的杆菌肽锌1500m g / k g 的抗生素组合，断奶仔猪日增重提高5.4% ～ 9.7%，饲料转化效率改善14% ～ 18%，腹泻率降低30% 以上。说明断奶仔猪日粮中使用天蚕素能起到显著促生长和保健作用。王阿荣 等在仔猪日粮中添加天蚕素抗菌肽研究发现，天蚕素抗菌肽能提高北京原种黑猪断奶仔猪的生产性能和机体免疫性能。雷东风 等研究发现饲粮中添加天蚕素抗菌肽能增加断奶仔猪平均日增重和饲料转化效率。李波 等在母猪产前30d 和产后21d 饲粮中添加400m g / k g 的天蚕素发现母猪的繁殖性能和仔猪的生长性能等指标均高于以抗生素作为添加剂的对照组。试验结果显示，添加天蚕素组活仔率提高5.6%，死胎率减少74%，仔猪腹泻率下降47%。
3.3 对肉鸡生长性能的影响
    单达聪 等研究发现，日粮中添加天蚕素抗菌肽能提高艾维茵肉鸡增重率(1.67% , P <0.05) 和采食量(5.46% )，降低料肉比(1.77% )。李波 等研究发现在肉鸡日粮中添加天蚕素抗菌肽可提高肉鸡的生产性能和抗病能力。在存活率方面，饲料中添加天蚕素抗菌肽组比对照组提高了0.26%。在料肉比方面，试验组比对照组降低了2.46%。即添加天蚕素抗菌肽的试验组上述指标明显高于抗生素作为添加剂的对照组。
3.4 对水产养殖动物生长性能的影响
    王冬冬 等研究发现，添加100m g / k g 天蚕素抗菌肽对鲤鱼末重和特定生长率具有显著的提高作用(P＜ 0.05)。黄沧海 等研究显示，在罗非鱼日粮中添加100m g / k g 的天蚕素抗菌肽，特定生长率可提高约3%，其它指标与添加250mg/kg 的8% 黄霉素无显著性差异。
4 展望
    抗菌肽具有新的抗生素类所需要的很多特性。它可以作为单独的抗菌剂使用，也可以与传统的抗生素联合使用发挥协同作用，作为免疫调制剂或中和内毒素，因此抗菌肽的临床应用潜力很大。尽管抗菌肽在杀灭一些敏感病菌时效果不如特定的传统抗生素好，但其优势之一就是能有效地作用于多重耐药性菌，其杀菌作用十分迅速且具有复杂的细菌胞内作用靶点，而不易形成耐药性。经过人工改造的天蚕素抗菌肽C A D 较原有天然天蚕素抗菌肽具有稳定性更好、抗菌谱更广、活性更高的优点。且作为饲料添加剂而言，以工程菌工业化发酵生产抗菌肽，可大规模生产，生产周期短，生产成本低且不受季节和气候变化等外在环境的影响。同时抗菌肽产品具有广谱抗菌作用，对畜禽具促生长、保健和治疗疾病的功能，属无毒副作用、无残留、无致细菌耐药性的一类环保型制剂，对畜牧生产，饲料加工的发展都有巨大的推动作用。要进一步推动抗菌肽的应用，还必须深入研究以下问题：①抗菌肽在生命体特别是高等生命体防御系统中的准确定位以及生物模式；②抗菌肽表达水平与各种疾病的相关性；③抗菌肽构效关系和作用机制；④抗菌肽作为药物制剂时的药代动力学相关问题；⑤杂合抗菌肽大规模高表达的生产方法。随着对抗菌肽更深入的研究和基因工程的进展及生化技术的提高，不久的将来抗菌肽的临床应用可以部分减少甚至取代抗生素的使用，给人类带来巨大的经济效益和社会效益。

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