百合病毒检测研究进展

百合( Lilium) 集观赏、药用、食用价值于一身，是农业栽培中重要的经济作物。近年来，随着全球百合种球贸易的扩大，我国百合进口、引种数量和种植面积的不断增加，加之不规范的种植和种球自繁，病毒病开始在各百合种植区迅速流行。据统计，我国百合病毒的发病率一般在40% ～ 50%，二代种球的带毒率在90%以上，病毒病已成为加速我国百合种群衰退的重要因素之一。目前已报道的百合病毒约有20 余种，还有植原体( Phytoplasma) 一种，其中以百合无症病毒( Lily symptomlessvirus，LSV) 、黄瓜花叶病毒( Cucumber mosaic virus，CMV) 和百合斑驳病毒( Lily mottle virus，LMoV) 等最为严重，其他各种病毒均为局部地区发生。百合病毒常复合侵染，主要对百合的叶片和鳞茎构成伤害，从而影响百合植株大小和产量，进而影响花枝长度、花色，降低品质。不同病毒在百合上表现相似症状，同种病毒在不同条件下的症状有很大变异，给病害的田间诊断和防治带来极大困难。当前我国百合切花用种球主要来源于荷兰进口和国内自繁，为防止百合病毒病随种球扩散与传播，就必须加强百合检疫和检测，而这有赖于建立灵敏、快速和可靠的病毒检测方法。近年来，百合病毒检测的研究已取得了一定的进展，主要方法有植物指示法、电子显微技术、血清学方法及分子生物学检测法。
1 指示植物法
    指示植物鉴定是最基本的百合病毒检测方法。通常采用汁液接种法将百合的汁液接种到指示植物上，然后根据指示植物的感病表现来研究百合是否带毒及病毒的生物属性和种类。根据病毒的不同，用于百合病毒检测的常见指示植物有心烟叶、番茄、昆诺藜、百日草、郁金香、千日红等。指示植物法虽然简单，但检测速度很慢，症状表现的时间最短需要10 ～ 20 d，长则需要30 ～ 90 d，且灵敏度较低，受季节限制严重，此外，指示植物园的维护费用也较高。Masuta 和Ryu 等研究发现侵染百合的植物病毒寄主范围很窄，毒原的繁殖几乎只能在百合上进行，通过传统生物学方法进行鉴定很难，病毒长期侵染百合，会发生寄主适应性变异，导致其寄主范围变窄，很难利用指示植物发进行检测，而有些只能由蚜虫传播的百合病毒不适合此种方法。因此，指示植物法应用的局限性较大。
2 电子显微技术
    电子显微技术( Electron microscope，EM) 的主要方法包括负染色法、超薄切片法、免疫电镜技术和胶体金免疫电镜等。目前，主要应用于百合病毒检测的是免疫电镜法。免疫电镜( Immunoelectron microscopy，ISEM) 是应用特异性抗血清与相应病毒产生免疫反应，经负染后于电镜下观察病毒粒子的一种方法。具有高的灵敏性和直观性，可以准确地确定病毒的种类。现在欧洲已将ISEM作为百合种球LSV、LVX 等病毒推荐检测方法之一，在检__疫及百合生产中广泛采用。免疫电镜技术的出现促进了电镜技术在百合病毒检测上的应用，但由于电子显微镜的造价较高，样品的制备繁琐、费用昂贵，所以应用受到了一定的限制。近年来发展起来一种胶体金免疫电镜技术，此法是先将样品与特异免疫球蛋白反应，再用蛋白A-胶体金标记，经负染后用电镜进行观察，由于胶体金的附着，在电镜下很容易检测出病毒粒子的存在，检测效果比免疫电镜法更佳，可用于快速检测和鉴定病汁液中线状病毒、棒状病毒以及球状病毒，大幅度提高同抗血清对病毒的捕获能力。胶体金制备容易，价格低廉，不仅可用于常规光镜，而且还可用于荧光显微镜，应用于快速检测技术还具有操作简单快速，特异性、敏感性好，可单份测定，结果直观，且可保存试验结果等优点。
3 血清学方法
    血清学方法以其快速、准确、适于批量检测的优点，已成当前国内外检测百合病毒的常用技术。血清学是利用抗原抗体的免疫学反应检测植物是否带病毒。检测百合病毒的血清测定方法主要有: 酶联免疫( ( EnzymelinkedImmunoassay，ELISA ) 、圆点免疫结合法( Dot-ELISA，DBIA) 和组织印迹法( Tissue Blot-ELISA，TBIA) 。ELISA 是目前百合病毒检测最常用的一种检测方法，大部分侵染百合的病毒都可由此种方法检出。荷兰Asjes用ELISA 对周年循环中初侵染和再侵染植物的百合无症病毒( LSV) 和百合斑驳病毒( LMoV) 的毒源率和病毒量进行监测。梁巧兰等利用ELISA 检测侵染观赏百合黄瓜花叶病毒的研究。刘成科等建立了百合无症病毒单克隆抗体制备及快速检测方法。现已商品化的ELISA 试剂盒有很多，如美国Agdia 公司的南芥菜花叶病毒( ArMV) 、烟草环斑病毒( TRSV) 、郁金香碎锦病毒(TBV) 、黄瓜花叶病毒( CMV) 、百合无症病毒( LSV) 等ELISA 试剂盒。圆点免疫结合法( DBIA) 用硝酸纤维素膜代替酶标板，使检测更为简便、快速和经济。而组织印迹法( TBIA)在前者基础上，直接把感病组织切块固定硝酸纤维膜上，然后利用抗原抗体特异反应来检测植物病毒。研究证实，TBIA 更灵敏，比DBIA 和ELISA 有更高的病毒检出率。而DIAB 在百合病毒检测上最主要的应用就是检测病毒在百合植株中的空间分布，在百合种球规模化病毒检测方面具有良好的前景，目前广泛地应用于百合病毒CMV、LSV、LMoV 的检测与调查，检测CMV 的灵敏度可达1． 2 g /ml，可检测出低浓度病毒的存在。
4 分子生物学法
    分子生物学技术是通过检测病毒核酸来证实病毒的存在的一种方法。常用的分子生物学检测技术包括核酸分子杂交技术、双链RNA 电泳技术、反转录PCR( RTPCR)技术。目前常用的方法是RT-PCR 技术，其突出的特点是特异性强、检测速度快、灵敏度高，将病毒检测灵敏度由血清学的ng 水平提高到了pg 级。可用于大量样品的检测，并且适应范围广，应用对象可以是RNA 病毒、DNA 病毒和类病毒。Hagita 等设计简并引物，采用RT-PCR 方法从染病百合中成功检测出百合X 病毒( LXV) 。刘毅等从进境百合中检出了南芥菜花叶病毒( ArMV) 。于翠等从进境百合中检出了草莓潜隐环斑病毒( SLRSV) 。韩丽娟等进行了侵染百合的李属坏死环斑病毒病( PNRSV) 的研究。RT-PCR 技术检测百合病毒无放射性危险，可以检测到pg 数量级的植物病毒及同时检测大规模的样品。而近年来，在RT-PCR 基础上发展起来一种多重RTPCR( muhiplex PCR) ，是在普通PCR 的基础上加以改进，在同一个PCR 反应体系中加入多对特异性引物，针对多个DNA 模板或同一模板的不同区域扩增多个目的片段的PCR 技术。由于多重PCR 同时扩增多个目的基因，具有节省时间、降低成本、提高效率的优点，特别是节省珍贵的实验样品，所以一经提出，即得到众多研究者的青睐，并且发展迅速，在生命科学的各个领域成为一项重要的研究手段。应用此法，徐榕雪等从东方百合杂种系“索蚌”( Oriental hybrids‘Sorbonne’) 中同时检出了黄瓜花叶病毒( CMV) 、百合斑驳病毒( LMoV) 和百合无症病毒( LSV) 。黎昊雁等以复合RT-PCR 方法同步检测百合X 病毒、百合无症病毒及百合斑驳病毒。利用分子生物学技术检测百合病毒的研究很多，随着分子生物学技术的发展，新技术不断推出，原有技术也在不断改进，近年来发展的基因芯片技术将无数预先设计好的寡核苷酸、cDNA、基因组( Genomic) DNA 在芯片上做成点阵，与样品中同源核酸分子杂交，对样品的序列信息进行高效的解读和分析，可大规模获取相关生物信息，在百合病毒检测上的发展前景广阔。