生物技术在蔬菜育种上的应用

从20世纪70 年代开始以细胞工程和基因工程为主体的现代生物技术应用于作物品种改良，把育种技术从宏观水平提高到微观水平。生物技术应用于蔬菜育种，是生物技术与常规育种的有机结合，具有创造变异多、育种目的性强、育种时间缩短、后代选择稳定快等优点，为培育高产、高抗、多抗、品质优良的新品种提供了科学的手段。
1 应用现状
1.1 细胞工程在蔬菜育种上的应用
    细胞工程是以细胞为基本单位，在离体条件下进行培养、繁殖或人为地使细胞的某些生物学特性按人们的意志发生改变，从而改良生物品种和创造新品种，加速动物和植物个体的繁殖，或获得某些有用的物质的过程。在蔬菜育种技术方面主要有植物离体培养、花药培养、原生质体培养、人工种子等几个方面。
1.1.1 植物离体培养技术
    植物离体培养包括胚胎培养、器官培养、组织或愈伤组织培养、细胞培养和原生质体培养等，是目前植物细胞、组织培养中应用最多、最有效的一种快速生产脱毒种苗的手段。其主要用于扩大变异范围、加速亲本材料的纯化、加速无性繁殖、获得脱毒苗、种质资源试管保存等。在蔬菜上已成功运用离体培养技术的国家有中、日、美、法、英、荷等10多个国家和地区。涉及的蔬菜品种有茄科的番茄、马铃薯、辣椒、茄子、甜椒等；十字花科的结球甘蓝、花椰菜、青花菜、花茎甘蓝、孢子甘蓝、芥菜、大白菜、小白菜、萝卜等；伞形花科的胡萝卜、芹菜、香芹菜等；葫芦科的黄瓜、西葫芦、甜瓜等；豆科的菜豆、豌豆等；菊科的莴苣、苦苣等；石蒜科的洋葱、韭菜、大蒜等几十种作物。在我国马铃薯、大蒜、姜等无性繁殖蔬菜茎尖脱毒快繁方面，已经形成了可靠的技术体系和可行的良繁体系，其中应用最成功、最广的是马铃薯脱毒、利用微型薯繁殖无病毒原种等。
1.1.2 花药培养技术
    花药培养是在无菌条件下取出充满花粉的花药，置于适宜培养基上培养，由花粉再分化出植物的方法。花粉与植物体的其它部位不同，染色体仅为体细胞的一半，故由其所分化的植物，其体细胞也是单倍体。从杂种的花粉再分化出的植物体进行加倍处理，可直接得到遗传上稳定的二倍体植物。此项技术从1964年印度学者Guha和Maheshwari成功地将毛叶曼陀罗的成熟花药离体培养获得单倍体植株以来，得到了快速发展。离体花药在培养条件下可经器官发生途径或胚胎发生途径分别产生单倍体植株，最早的花药培养再生单倍体植株是经胚状体途径形成的，蔬菜中辣椒、茄子、大白菜等植株较易形成花粉胚，而芦笋、番茄等多经器官发生途径形成单倍体植株。我国于1970 年开始在单倍体育种方面进行研究，目前已有40 种以上植物的花粉或花药发育成单倍体植株，主要集中在十字花科的结球白菜羽衣甘蓝、芜菁和萝卜、茄科(辣椒、马铃薯)和葫芦科的黄瓜，其中辣椒、甜菜、白菜等的单倍体植物为我国首创。
1.1.3 原生质体培养与体细胞杂交技术
    原生质体培养与体细胞杂交育种原生质体培养是细胞工程的核心内容，在植物快速繁殖、远缘遗传重组、转移基因尤其是多基因控制性状，以及在创造新类型及品种改良上具有广阔的应用前景。1960 年，英国Cooking 首先从番茄茎尖细胞分离到原生质体，同时也是世界上首先分离到植物的原生质体。至今蔬菜作物可供作原生质体分离，培养、植株再生、细胞融合等试验的已有14 个科的几十种作物，已获得体细胞杂种蔬菜有马铃薯+番茄、白菜+甘蓝、萝卜+油菜，以及胡萝卜+香芹等。我国科学家在蔬菜原生质体培养与融合领域内也取得很大的进展，先后由原生质体培养而获得再生植株的蔬菜品种有紫红萝卜、黄瓜、甘蓝、芥菜和胡萝卜等。体细胞杂交，为克服植物有性杂交不亲和性、打破物种之间的生殖隔离、扩大遗传变异等提供了一种有效手段。自1972 年获得世界上第一个植物体细胞杂种烟草细胞以来，至今体细胞杂交已应用于蔬菜育种并取得了一些成果，如“马铃薯×番茄”、“甘蓝×白菜”、“胡萝卜×香芹”等。我国学者在原生质体融合方面做了很多工作，侯喜林等利用原生质体融合技术获得了不结球白菜胞质杂种。司家刚等采用原生质体非对称融合技术获得了胡萝卜种内胞质杂种。连勇等应用原生质体电融合技术获得了茄子近缘野生种与栽培种的种间体细胞融合四倍体再生植株。李省印等得到能再生出菌丝体和子实体的平菇种内杂交株，其中选育出的“优生1 号”品系，适应性强、优质、丰产、耐热。
1.1.4 人工种子
    人工种子的成功不再需要每年配制杂交种，其“种皮”和“人工胚乳”可加入种子发芽生长必须的营养物质和抗病虫害、除草剂等特殊物质。利用体细胞培养诱导体细胞胚的发生代替种子进行田间播种，在蔬菜杂种优势的利用上前景诱人。我国从1987 年开始将人工种子研究纳入国家高新技术发展计划项目，先后在胡萝卜、苜蓿、芹菜等蔬菜的开发应用上获得了阶段性成果，汤绍虎等以蕹菜小叶品种带芽节段为繁殖体，用质量分数4％的海藻酸钠包裹制作了人工种子；沈颖等以甘蓝下胚轴为外植体诱导再生植株，并制作人工种子，为抱子甘蓝及人工种子制作的推广应用奠定了基础。
1.2 分子标记技术在蔬菜育种上的应用
    遗传标记是基因型特殊的、易于识别的表现形式。分子标记技术的出现，使植物育种中的“间接选择”成为可能，大大提高遗传分析的准确性和选育种的有效性，因而在遗传育种领域愈来愈受到重视，将二者有机结合是今后育种工作的趋势。分子标记包括同工酶标记和DNA 标记。
1.2.1 同工酶标记
    自70 年代以来，同工酶作为一种直接的基因产物，在作物遗传育种中得到广泛的应用，相对于形态性状标记，它具有一些独特的优点。首先它受环境因素影响较小，表观出相对的稳定性；其次多种同工酶可以在种子或幼苗中表达，有利于进行早期鉴定。通过比较不同同工酶酶谱带型的差异，对许多蔬菜作物的亲缘进化关系如西瓜、马铃薯、萝卜、大白菜、花菜、茄子等进行了研究。由于等位基因同工酶受共显性等位基因控制，杂种表现互补型酶谱或杂种型酶谱，因此该技术适用于杂种纯度检测，目前已对甘蓝、大白菜、黄瓜、西瓜、番茄等多种蔬菜进行了纯度鉴定。
1.2.2 DNA 分子标记
    DNA 分子标记是指电泳后能以一定的方法检测到的反映基因组某种变异特征的DNA 片段。这种DNA 片段可以通过限制性内切酶切割，PCR 扩增或两者结合起来获得。因此，DNA 标记主要包括三大类：第一大类是基于DNA 分子杂交的方法，主要指限制性片段长度多态性，即RFLP。第二大类是基于PCR 技术的DNA 扩增方法。它又分为两类，一是使用随机引物进行扩增，主要指随机扩增多态性DNA 技术；另一类标记是采用特定引物或引物对扩增的标记，主要有SCAR、STS、微卫星DNA 等。第三大类是PCR 与酶切相结合的方法，主要指AFLP 和CAPS 两类。因为生物各种性状的差异主要是遗传物质DNA 的差异造成，因而通过DNA 分子标记可以直接检测基因组的遗传变异，它更能准确揭示同一物种内不同种、变种、品种、品系间个体的差异。DNA 作为分子标记可以避免用形态和同工酶检测遗传变异所固有的许多问题和倾向，它具有以下特点：（1）较高的可靠性，因为DNA 标记直接检测遗传物质DNA，几乎不受环境因素、取样部位和发育阶段的影响，不影响目的基因的表达，与不良性状无必然的连锁。（2）DNA 标记在数量上几乎没有限制。（3）很多分子标记表现为共显性，能鉴别纯合基因型与杂合基因型，提供完整的遗传信息，因此，DNA 分析技术不仅广泛应用于遗传图谱构建、基因定位等方面，而且在作物种质资源研究中也具有重要意义，被认为是鉴别品种、品系及分析种质资源遗传多样性的有力工具。目前已对番茄、莴苣、辣椒、甘蓝、胡萝卜等多种蔬菜作物构建了饱和或部分饱和的RFLP 遗传图谱。Landry 等曾发现一个RFLP 位点与抗霜霉病基__因是紧密连锁，此外，与番茄的抗烟草花叶病毒基因，抗枯萎病基因，控制株型的基因（sp），影响果实成熟的基因（u）连锁的RFLP 位点也先后被发现。在种质资源研究方面，它在芸薹属、茄科等蔬菜作物的物种起源与进化研究中曾发挥了很大作用。另外，在甜瓜、甘蓝等蔬菜不同品种之间的亲缘关系研究也有报道。在种质资源亲缘关系研究中也有显著的成绩，如芸薹属及其相邻基因组，不同地域来源的芥菜、番茄、葱属、黄瓜等。目前已从分子水平对大白菜、芥菜、花椰菜、西瓜、番茄等品种（杂种）进行了快速鉴定，在标记辅助育种方面，RAPD技术更以其丰富的多态性和操作的简便性深受研究者的青睐，已构建了甘蓝、番茄、胡萝卜、莴苣、辣椒等的遗传图谱，发现多个连锁分子标记如：与番茄抗TMV 基因连锁；与西瓜抗枯萎病基因连锁；与西瓜野生种质资源耐冷性基因连锁；与甘蓝雄性不育基因连锁的RAPD 标记等等，利用这些连锁标记，能大大提高育种过程中的选择效率，减少不必要的人力和物力。

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