蝴蝶兰组培快繁技术研究进展

蝴蝶兰，兰科蝴蝶兰属植物，属热带、亚热带气生兰。原产于菲律宾、印度尼西亚、泰国、马来西亚和我国台湾等地，其株型美观、花形奇特似蝶、枝叶繁茂， 花朵硕大、花色鲜艳、花期持久，观赏价值极高， 在热带兰中素有“兰花皇后”的美誉，有较高的观赏和经济价值，深受国内外花卉市场的欢迎。但是，由于蝴蝶兰是单茎性气生兰， 植株很少发育侧枝，很难采用常规分株方式进行无性繁殖。 其种子也不含胚乳或其他组织， 在自然条件下萌发率极低， 因此无法利用播种方式进行有性繁殖。而采用组织培养方法进行种苗繁殖是目前蝴蝶兰大规模生产的唯一途径。蝴蝶兰快速繁殖的途径主要是利用无菌播种和利用各种类型的外植体诱导类原球茎， 进而诱导分生苗实现快繁， 不用通过诱导愈伤组织而直接分化丛生芽。
1 蝴蝶兰组培快繁的影响因素
1.1 无菌播种途径 蝴蝶兰种子的胚发育不完全，不易发芽，用人工合成的培养基促使种子无菌萌发，可以得到较高发芽率。种子培养过程中使用的培养基有KC、MS、花宝等，其中改良KC 培养基是蝴蝶兰种胚萌发的理想培养基。对不同无菌播种方法包括撒播法、涂布法、稀释法进行了比较，结果表明稀释法较好，种子分布均匀，利用率高，明显减少转接次数，且原球茎发育健壮整齐。果龄采收期也影响着无菌播种效果。也可采用无菌播种途径快繁蝴蝶兰，能够在短期内获得大量幼小植株，且技术简单、成本较低，是现阶段经济有效的快速繁殖方法，也是工厂化育苗的重要途径。但由于蝴蝶兰种子苗是一种杂交品系，因此后代变异率高，除了少数自花系列较稳定以外，难以形成品质均一的大规模栽培品种。因此，在采用无菌播种进行蝴蝶兰种苗生产时，要对父母本进行严格的选择，以确保后代性状的尽可能一致。
1.2 类原球茎途径 原球茎是兰科植物组织培养产生的特有现象，通过离体器官诱导原球茎快繁法获得试管苗基本一致，增殖系数较高，变异性较少，适合大规模繁殖，是兰花组培快繁的一个主要形式。近年来， 国内外学者对蝴蝶兰的组织培养技术进行了大量研究， 蝴蝶兰组织培养诱导原球茎的外植体有茎尖、叶片、花梗腋芽、花梗节间切段等诱导类原球茎， 进而诱导分生苗实现快繁。蝴蝶兰的繁育方法有两种丛生芽和原球茎增殖。原球茎增殖容易出现变异，采用丛生芽增殖能够很好的保持原有品种的特性。还可利用花梗腋芽、叶片等作为外植体接种在不同培养基上进行离体培养，再利用诱导产生的不定芽的茎尖进行茎尖培养，可得到大量的原球茎状体。由于茎尖作外植体诱导原球茎诱导率、周期性，但损伤母株，而且还会有不同程度的污染率，故利用腋芽萌发的不定芽的幼叶为外植体，虽然诱导率稍低，但大大降低了污染率。大量研究表明， 在蝴蝶兰进行组织培养过程中， 选取的外植体不同， 原球茎的诱导率也有很大差异， 其中幼叶、茎尖、花梗腋芽是蝴蝶兰原球茎诱导的较佳外植体， 叶片和根段的诱导效果最差。但是，采用茎尖作外植体会对植株造成损伤，因此蝴蝶兰的组织培养通常以幼叶或花梗腋芽为外植体。
1.3 培养基的选择与激素的添加 蝴蝶兰组织培养采用的基本培养基有MS、1/2MS、VW、B5、KC、花宝及其改良型等。在原球茎的诱导过程中，不同的蝴蝶兰品种和外植体对最适培养基的选择有所不同，其中以MS基本培养基最为常用，且适当减少培养基中大量元素和部分微量元素的添加量有利于原球茎的增殖。一般情况下，原球茎在基本培养基上即可增殖、分化，但在基本培养基中附加适量激素或其他添加物可显著促进原球茎的增殖与分化。目前，在蝴蝶兰组织培养中常用的激素有GA3、6 - BA、NAA、2， 4 - D 和IAA等。蝴蝶兰组织培养中不同阶段对培养基和激素配比的要求也不同。蝴蝶兰无菌播种诱导胚状体以MS7为基础培养基，添加100 g/L新鲜土豆汁效果较好，有利于原球茎的分化和生长。在诱导胚状体时激素浓度要求较低，在胚培养时，只加MS培养基的部分成分即可，添加细胞分裂素和生长素易使胚生长畸形或抑制胚的生长。并在MS7培养基中，随着NAA浓度的升高，生根率呈现先升后降的趋势，单独使用NAA诱导生根，浓度以0.5mg/L为好，高浓度BA抑制生根。因此，诱导蝴蝶兰生根的较为理想的激素配比为BA0.1 mg/L+NAA0.5 mg/L，植株生根率高，根数多，生根长。利用已过盛花期带休眠芽的花梗作为外植体材料，通过对不同配比的培养基和激素的选择，其中发现花梗腋芽最佳诱导培养基为1/2MS+BA2.5 mg/L+NAA0.2 mg/L，即随着BA浓度的增大，蝴蝶兰花梗腋芽诱导率逐渐升高，在相同时间内，细胞分裂素的增加，芽诱导率也随之增加。继而利用不同激素和浓度的培养基对蝴蝶兰进行增殖培养，发现：1/2MS+BA3.5 mg/L+KT1.0 mg/L+NAA0.5mg/L+10%椰汁最有利于蝴蝶兰丛生芽的增生，且叶片健壮。取花梗腋芽诱导获得的无菌苗的叶片作丛生芽诱导材料、茎尖作原球茎诱导的材料。研究发现：花梗腋芽的丛生芽诱导培养基以1/2MS+6-BA5.0 mg/L+NAA2.0+CM15.0%培养基最合适，其中增殖仍需高浓度6-BA与低浓度的NAA混合使用。叶片诱导丛生芽以1/2MS+6-BA5.0 mg/L +NAA2 mg/L+香蕉泥10.0%+AC0.2%的培养基最宜，可见叶片丛生芽诱导仍需较高浓度的6-BA 和中等浓度的NAA 及香蕉泥混合使用。丛生芽增殖阶段1/2 MS+6-BA7 mg/L+NAA0.5 mg/L+香蕉泥10.0%+AC0.2%培养基效果最好，可见丛生芽的增殖仍需高浓度6-BA与低浓度的NAA 混合使用。
1.4 光谱LEDs的影响 光谱对植物的生长发育、形态建成、光合作用、物质代谢以及基因表达均有调控作用， 通过光质调节和控制植株形态建成和生长发育， 可使植株在一定程度上满足人们生产需要。单色红光处理的蝴蝶兰组培苗徒长， RBG(红光/蓝光/绿光) 处理组全部生根， 单色蓝光处理的组培苗根系活力最高。红蓝组合和单色蓝光处理的叶片色素含量高于白光，叶绿素a /b比值、叶绿素a /类胡萝卜素比值随着R /B比率的降低而减小。可溶性糖、蔗糖、游离氨基酸和淀粉的含量及C /N(碳氮比)在单色蓝光下均高于单色红光处理。
2 蝴蝶兰组培过程中的褐变问题
    褐变是由酚类物质酶促氧化形成的醌类物质，再进一步聚合成褐色物质而产生的。褐变在植物组织培养过程中普遍存在，而在兰科植物组织培养过程中，褐变的严重发生在很大程度上制约了其成功率。赵滢等为了明确蝴蝶兰组培褐变的生理机制，以组织培养过程中褐变程度不同的蝴蝶兰品种为材料，对叶片外植体组培过程中酚类物质代谢及活性氧代谢的相关指标进行了测定。结果发现：蝴蝶兰叶片外植体组培褐变程度与总酚含量没有直接关系，褐变的发生与外植体膜脂过氧化损伤关系密切，并可能由PPO催化酚类物质引起。目前控制褐变的常用方法是在培养基中加入活性炭和PVP，用以吸附分泌到培养基中的有害物质，但这样会抑制蝴蝶兰外植体分化和芽的产生。近年来发现，热激处理可以减轻褐化的发生。在采用热激处理抑制组织培养褐变的过程中发现：45℃条件下热激处理10 min，其中热激处理后立即进行接种的褐变程度最重，处理后24、72 h接种的，褐变程度稍轻，处理后48 h接种的褐变最轻。以及发现pH不同，培养物排出的褐变物质也不同，pH为4.5～5.0时，培养物排出的褐变物质较多，pH为5.4-5.5时排出的褐变物质较少，这可能与柠檬酸抑制了多酚氧化酶的活性或增强了醌类化合物还原剂有关。
3 建议
    蝴蝶兰是重要的切花和盆花，具有很高的经济价值，国内外在蝴蝶兰组培快繁方面取得了一定的进展，但仍然存在繁殖系数低、增值难、继代周期偏长等问题，再有如培养基的选择、激素种类与配比、以及培养方式上的研究结果有一定的不一致性，这说明不同品种、不同外植体对培养基和培养要求也大大的不同。此外，目前关于蝴蝶兰的组培快繁和生理的研究较多，但对于新品种的选育很少，以至研究品种较为单一，因此应加强蝴蝶兰的育种工作，培育观赏性强、生长快、且易于栽培的新品种。