酶联免疫吸附测定法ELISA 技术在畜牧业中的应用

2  酶联免疫技术安全检测中的应用
2. 1  动物传染病的诊断 猪伪狂犬病( Pseudo rabies, PR) 是由伪狂犬病病毒( Pseudo rabies Virus,PRV) 引起的以发热和脑脊髓炎为主要特征的急性、热性传染病。一般幼龄仔猪发病率和死亡率可高达100% , PR 的传播和蔓延, 给养猪业造成了巨大损失, 全世界每年因PR 造成的经济损失高达数十亿美元 。Af shar、Bush 等分别建立了检测PRV 抗体的间接ELISA 方法 。T jeerd G Kimman 等用杆状病毒表达系统表达了PRV 糖蛋白 14 郑州牧业工程高等专科学校学报第30 卷gE 并构建了间接ELISA。表达所用的gE 基因片段是gE 的主要抗原位点而不是跨膜区, 该基因被克隆在PRV gG 标记序列和杆状病毒表达载体的p10 启动子后, 被高效表达。与其他的商用试剂盒一起对感染过PRV 的一系列血清作检测, 结果表明, 所建立的间接ELISA 具有高度的特异性和中等程度的敏感性 。邱德新等用辣根过氧化物酶( HRP) 标记纯化的兔抗猪IgG 制备出高效价的酶标抗体, 工作浓度为1 50000; 经各种条件的筛选,建立了检测猪PR 血清抗体的间接ELISA。与猪支原体、猪瘟、O 型口蹄疫、猪细小病毒标准阳性血清呈阴性反应, 与临床未感染PRV 的猪血清和猪PR标准阴性血清呈阴性反应; 与临床发病猪血清、猪免疫猪血清和PR 标准阳性血清呈明显的阳性反应。猪瘟( Classical Sw ine Fever, CSF) 又称猪霍乱( Ho g Cholera, HC) , 是由猪瘟病毒引起的猪的一种急热性致死性疾病。猪瘟具有高度接触传染性,流行广泛, 发病率高、死亡率高, 危害极大。近几年主要表现在从频发的大流行转变为无规律的散发性流行; 疫点显著减少, 临床症状从典型变为非典型,病原毒力降低, 病程由急性、亚急性转变为慢性为主, 出现持续性感染、胎盘感染、母猪繁殖障碍以及新生仔猪的先天性感染。余兴龙等以在大肠杆菌高效表达的猪瘟病毒E2 基因主要抗原编码区( mE2)为抗原, 以辣根过氧化物酶( HRP) 标记的兔抗猪IgG 为二抗, 建立了检测猪瘟病毒抗体的间接ELISA 方法。经检测筛选出最佳反应条件为: 12g/ 孔纯化的表达大肠杆菌的mE2 重组蛋白包被酶标板, 用10 %的兔血清或马血清进行封闭, 以正常大肠杆菌裂解上清液稀释待检血清。试验表明应用重组mE2 蛋白作为诊断猪瘟的抗原, 具有特异性高、易纯化和成本低等特点 。
2. 2  药物残留的检测 畜产品中药物的残留是指在养殖过程中, 为防病治病而人为添加的、在生物体内产生积累或代谢不完全的药物。违禁用药或药残超过安全限量的畜产品, 摄食后将直接危害人体健康。现在国际上比较重视的残留药物有抗生素、激素类、磺胺类、呋喃类、喹诺酮类等。在抗生素残留的检测中, 目前最常用的是微生物抑制分析方法、高效液相色谱( HPLC) 、气相色谱( GC) 、气质联用( GC - MS) 等, 但这些方法有它们的局限性。微生物法缺乏灵敏度和特异性; HPLC、GC 检测则样品的前处理耗费大量的时间, 并且需要昂贵的实验室设备。使用ELISA 法样品前处理简便, 同时可分析多个样品, 分析时间短, 且敏感度高, 特别适于做日常大量样品的筛选工作, 同时也减少HPLC、GC 方法较高的成本并避免造成环境污染。猪肉组织中药物残留检测已有报道。2000 年,Ko E 等研究直接竞争性酶联免疫吸附检测猪肉中的磺胺二甲基嘧啶( SMz) 。抗体经亲和层析净化后包被微量滴定板。在猪肉组织中加人磺胺二甲基嘧啶, 用二氯甲烷提取。提取的SMz 用自建ELISA方法、ELISA 试剂盒、高效液相色谱( HPLc) 测定,结果较为理想。抗体包被的酶联反应板置40  温度放置14 d 均未发现灵敏度变化。此试验自建的ELISA 方法在猪肉组织中SMz 检测限量为10 ng/g , 这种方法可以应用在畜产品sMz 检测中 。乳类食品检测药物残留已经发展了很多种, 目前研究方向已向着多残留检测发展。2003 年,Loomans KE 等建立ELISA 方法同时检测牛奶中的庆大霉索、卡那霉素和新霉索。研究者首先用一种抗体建立ELISA 方法同时检测牛奶中的庆大霉素、卡那霉素和新霉素三种药物残留。用新霉胺半抗原通过EDC( 碳化二亚胺法) 偶连蓝白蛋白大分子作为免疫原免疫家兔产生的多克隆抗体建立ELISA 方法 。
2. 3  生物毒素的检测 畜产品中常常涉及的生物毒素是真菌毒素。其中主要是黄曲霉毒素。黄曲霉毒素( AFT) 是由黄曲霉和寄生曲霉产生的一组次生代谢物, 其中黄曲霉素B1( AFB1) 毒性最大, 分布也最广, 已正式被定为人类的致癌物质, 是饲料中的典型毒素之一。早在1998 年, 我国就确定了饲料中AFB1 的ELISA 检测方法的国家标准。近十几年来, 用于生物毒素检测的ELISA 方法得到迅速发展, 已有多种可靠的ELISA 诊断试剂盒用于分析不同的毒素 。与HPLC 和LC - MS 的广泛比较,证明ELISA 同样具有较高可信度。陈兰明等采用辣根过氧化物酶( HRP) 标记高亲和力的黄曲霉毒素B1 抗体, 建立了标记抗体型直接竞争抑制ELISA 快速筛选法。该法检测A FB1 的线性范围为0. 25~ 5. 0 ng/ mL, 灵敏度为12. 5 pg 。

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