转基因番茄的研究现状及其产业化

番茄(Solanum lycopersicum)是一种世界性蔬菜,在蔬菜生产中占有举足轻重的地位, 也是基础生物学研究中的重要对象和模式植物, 在所有蔬菜作物中番茄的研究文献居于首位。由于番茄研究深入,而且易于转化, 转基因番茄研究与应用得到了迅速的发展。随着转基因技术的成熟与发展, 越来越多的转基因番茄已被研制成功, 并逐步走向产业化阶段。本文就目前转基因番茄的研究以及产业化情况进行概述, 为进一步进行转基因番茄研究工作提供重要的基础信息, 同时也为进行转基因番茄的管理和研究提供理论基础。
1 转基因番茄的研究现状
    目前, 在抗病虫害、抗除草剂、抗逆、延迟成熟、雄性不育等方面已经获得了转基因番茄植株, 同时利用番茄作为植物反应器生产医药蛋白的基因工程研究也取得了长足的进展。
1.1 抗病转基因番茄
    抗病育种一直是育种工作者的主要育种目标,转基因番茄可以弥补常规抗病育种工作的不足, 从而获得常规育种不能获得或很难获得的抗病番茄种质资源, 因此引起了科研人员的极大兴趣。目前抗病的转基因番茄主要包括抗病毒、抗真菌及抗细菌病害等3 个方面的研究内容。
1.1.1 抗病毒转基因番茄
    烟草花叶病毒(TMV)、黄瓜花叶病毒(CMV)、苜蓿花叶病毒(AMV)和番茄黄花卷叶病毒(TYLCV)等是引起番茄病毒病的主要病原。在番茄转基因抗病毒育种中, 主要利用病毒的外壳蛋白(Coat protein,CP)基因、复制相关蛋白(Replication-associated protein,REP)基因、卫星RNA 基因和病毒片段的反义RNA 基因等。外壳蛋白(CP)在转基因植物中的积累可以干扰病毒脱衣壳, 抑制病毒在植物体中的复制、转运和积累从而使转基因植株获得了病毒抗性。1986 年, Powell 等首次将烟草花叶病毒外壳蛋白基因(TMV-CP)转入番茄, 这是第一例有成功报道的转基因番茄。我国首例批准商品化的抗病毒的转基因番茄也是利用CP 蛋白实现的, 此后, CP 蛋白和REP 蛋白多次用于番茄的抗病毒基因工程中。利用反义RNA 技术, 通过设计病毒复制原点区域序列的反义RNA 或反转录病毒模板的反义RNA, 最终阻断病毒的增殖, 达到抑制病毒的作用也是番茄抗病毒研究的一个策略。朱秋菊利用反义RNA 技术,构建了反义CMV-CP 的植物表达载体, 进行番茄转基因研究, 得到具有CMV 抗性的转基因植株。RNA干扰(RNAi)技术在番茄的抗病毒研究中也起到了重要作用, Tamarzizth 等利用RNAi 技术将TYLCV 病毒的截短型复制相关蛋白基因正义/反义构建到RNAi 表达载体上进行番茄转化, 转基因植物可抑制TYLCV 的复制, 得到高抗TYLCV 感染的转基因植株。MicroRNA 具有重要的调节功能, 包括生长发育、形态建成、逆境应答、激素反应和病毒诱导等,因此microRNA 基因的挖掘与利用是这几年的研究热点。Zhang 等构建了两个含有2a、2b 基因和病毒CMV 的3′UTR 的microRNA 载体并进行了番茄转化, 转基因后代对CMV、TMV 及TYLCV 产生了抗性。
1.1.2 抗真菌病害转基因番茄
    能引起番茄真菌病害的病原菌种类多、范围广,受到广大育种工作者的重视。在番茄的抗真菌病害基因工程中, 目前研究较多的是几丁质酶基因、葡聚糖酶基因、番茄自身的抗病基因、植保素基因等。几丁质酶和葡聚糖酶可以降解病原菌的细胞壁, 从而破坏病原菌, 降低真菌的侵染性。1995 年,Jongedijk 等将烟草I 型几丁质酶和β-1,3 葡聚糖酶转入番茄中, 成功表达这两种酶的转基因番茄植株在接种枯萎病镰刀菌(Fusarium Oxyspersici f.sp. lycopersici)后表现出一定抗性。Chen 等将水稻的几丁质酶基因和苜蓿的防御素基因同时转化到番茄中,经接种灰霉病病原菌Botrytis cinerea 鉴定, 同时含这两种基因的转基因植株表现出对灰霉病的高抗性。植物的植保素和抗菌蛋白在植物受到病原菌侵染时可以调动自身的防御反应, 加强抗病性。Thomzik 等将葡萄的Vst1 和Vst2 两个基因(植保素合成的前导基因)转入到番茄中后, 转基因番茄植株可产生反式白梨芦醇(植保素的一种), 使番茄植株表现出对番茄晚疫病的高抗病性。多年来, 大量的研究使转基因抗真菌病害取得了长足的进展, 但同时抗多种病害的转基因番茄还鲜有报道。Khan 等将山嵛菜的芥末防卫素基因(WD)利用多元自主转化载体转入到番茄中, 转基因植株对B.cinerea (灰霉病病原菌)、Alternaria solani (早疫病病原菌)、F. oxysporum (枯萎病病原菌) 和 Erysiphelycopersici (白粉病病原菌)均产生抗性。
1.1.3 抗细菌病害转基因番茄
    番茄的细菌病害主要有细菌性斑点病、青枯病及溃疡病等。Tai 等利用转基因技术将来源于辣椒的Bs2 基因(细菌性斑点病抗性基因)转入番茄中, 获得的转基因植物对由黄单孢菌(Xanthormonas campestris)引起的细菌性斑点病的抗病性明显提高。转化学合成的巨大蚕蛾的阳离子溶菌肽B 的番茄植株, 接种细菌性青枯病(Ralstonia solanacearum)和细菌性斑点病(X. campestris pv. vesicatoria)病原菌后, 转基因植株对两种病害均表现出高抗病性。乙烯在番茄植株抗溃疡病(Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis)中起到重要作用, Balaji 等将细菌ACC 脱氨酶基因ACD(Bacteriac ACC deaminase)转入到番茄中, ACD 基因超量表达阻碍了乙烯的合成,转基因植株中溃疡病的病症发生推迟。
1.2 抗虫转基因番茄
    在抗虫转基因番茄研究方面, 主要应用的是来自苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiens)的Bt 基因。1987 年, Fischhoff 等首次用Ti 质粒将Bt 毒素蛋白基因CryIA(b)转入番茄, 在CaMV 35s 启动子的控制下, 转基因植株大大地提高了对烟草天蛾的抗性能力, 同时转CrylA(b)和CrylC 基因的番茄植株可对甜菜夜蛾、烟草夜蛾产生抗性。植物中的抗性基因也有应用报道, 如利用雪花莲外源凝集素基因(GNA)产生抗蚜虫的转基因番茄, 利用白杨的几丁质酶基因(WIN6)可降低马铃薯甲虫对转基因番茄的侵染。此外, Chen 等将从普通番茄抗根结线虫品系中克隆得到的根结线虫抗性基因(Mi 基因)转入到易感番茄品系中, 转化植株的抗根结线虫能力显著提高。2010 年, Chan 等将芋头的半胱氨酸蛋白酶抑制剂CeCP1 基因转入到番茄中, 获得了对根结线虫的侵染和繁殖均有抑制作用的转基因番茄。
1.3 抗逆转基因番茄
    国内外对番茄抗逆的转基因研究主要集中在耐盐、耐寒、耐旱、耐热等方面, 其中耐盐、耐寒的研究尤为深入。自1991 年Hightower 等将比目鱼体内的抗冻蛋白(AFP)基因转入番茄、1997年黄永芬等将美洲拟蝶鱼的AFP 基因导入番茄获得了抗冷性提高的转基因番茄植株, 拉开了抗冷转基因番茄的帷幕。随后, 赵春梅等将由CaMV 35S启动子驱动的内质网小分子热激蛋白(ER2sHSP)基因导入番茄, 在冷胁迫下, 转基因番茄的冷害症状减轻, 叶绿素含量损失少, 体内积累的丙二醛(MDA)含量少, 电解质外渗程度低, 具有较高的净光合速率和最大光化学效率, 具有较强的冷胁迫耐性。Singh 等采用Rd29A 启动子, 将At-CBF1 转化到番茄中, 转基因T1 代植株在形态学和农艺学性状上与非转基因植株无差别, 但耐冷性提高了40%(4℃处理3 d), 转基因植株SOD、NPQ 增高, MDA 含量降低。此外, 番茄耐热及耐旱基因工程也进行了大量研究。将拟南芥C 重复/脱氢反应结合因子1(CBF1)基因转入番茄, 在逆境条件下, 可提高植株对冷害、干旱及盐胁迫的适应 。Cheng 等 将酵母SAMDC(S-adenosyl-I-methionine decarboxylase, S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶)基因通过叶盘法转入到番茄中,转基因植株可经受38℃高温。Pan 等研究表明, 在番茄中表达缺失EAR域的ERF II 型蛋白可提高植株的整体抗逆性。Li 等将草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)的细胞凋亡抑制基因SflAP 转入到番茄后,转基因番茄对热胁迫、盐胁迫、付马菌素(FB1)及早疫(Alternaria alternata)病抗性均比对照提高。microRNA 在番茄的抗逆中也有应用, SlymiR169c负调控番茄干旱反应的气孔运动, 过量表达Sly-miR169c 可以降低气孔打开、减少蒸腾速率、降低叶片失水度、提高抗旱性, 而转ath-miR399d番茄可以增加根部对P 的吸收。
1.4 抗除草剂转基因番茄
    作物中除草剂的解毒或降解主要利用来源于植物或微生物的解毒酶的作用, 主要包括：(1)针对莠去津的谷胱甘肽S-转移酶或谷胱甘肽转移酶; (2)针对溴草腈的腈水解酶(由bxn 基因编码); (3)针对草丁膦的草丁膦乙酰转移酶PAT(由Bar 基因编码); (4)针对有机磷农药的水解酶OPH(Organophosphorushydrolase)的编码基因opd (Organophosphorus pesticidedegrading)。转基因番茄的抗除草剂性能主要通过修饰或过量表达除草剂作用的靶蛋白或转入解毒酶的手段来实现。Bar 基因可乙酰化草丁膦的自由氨基使草丁膦失去作物毒性; EPSP 合成酶(5-enolppyruvylshikimate-3-phosphate synthetase)是草甘膦作用的靶标, 通过EPSP 合成酶突变基因, 可以使作物对草甘膦的亲和力下降, 从而得到抗草甘膦植株。现已获得抗草丁膦的转Bar 基因番茄和抗草甘膦的转突变的EPSP 合成酶基因番茄等。此外, 利用opd 基因得到的转基因番茄具有水解有机磷农药蝇毒磷的活性, 最大酶活约11.59 U/mg 可溶性蛋白。
1.5 耐贮及延熟的转基因番茄
    耐贮及延熟的转基因番茄主要通过抑制细胞壁降解或抑制乙烯合成来实现。乙烯的最初前体是甲硫氨酸, 首先甲硫氨酸经腺苷甲硫氨酸水解酶(S-adenosylmethionine hydrolase, SAMase)作用合成SAM (S-腺苷-L-甲硫氨酸), SAM 在ACC 合成酶的作用下合成ACC, 然后ACC 在ACC 氧化酶(EFE)的作用下分解出乙烯, 而这两种酶被大的基因家族所编码。如果在植物体内表达ACC 合成酶或ACC氧化酶的反义RNA, 就会延迟成熟。我国第一个商品化的转基因番茄就是通过转反义的EFE 基因实现的, Kramer 等也利用编码SAMase 的基因获得了转基因成熟延迟的番茄植株。另外, 细胞壁水解酶与果实的成熟也有密切关系, 世界上首例商品化的转基因番茄Flavr SavrTM 是通过转反义的多聚半乳糖醛酸酶PG 基因, 使细胞壁的果胶降解而得到的耐贮番茄的例子, 转反义PG 基因降低了转基因番茄的PG 酶活性, 改良了果实风味、颜色及甜度, 最重要的是延长了果实的货架寿命。随后, Wang 等将脱氧辅蛋白酶(Deoxyhypusinesynthase)基因分别转入番茄, 也获得延迟成熟的番茄植株。
1.6 品质及风味改良的转基因番茄
    目前改良番茄品质的研究主要有增加番茄甜度、提高番茄可溶性固形物和番茄红素含量(表3)。Bartoszewski 等将非洲竹芋(Thaumatococcusdaniellii Benth)中的奇异果甜蛋白基因转入番茄中,经感官测试, 转基因番茄的甜度显著高于对照。Neily 等 将苹果中的亚精胺合成酶基因(Md-SPDS1)转入到番茄中, 番茄红素的合成酶酶系表达量升高, 降解酶酶系表达量下降, 使转基因番茄中番茄红素量增加。Carmi 等在番茄子房中特异表达发根农杆菌rolB 基因, 得到单性结实番茄, 转rolB 基因的植株具有植物生长素的特性, 该转基因番茄在早产性、丰产性及可溶性固形物均有所提高。风味也是影响番茄销量的重要品质, 1996 年, Wang等在番茄中表达了酵母D-9 脱饱和酶基因, 使番茄中影响风味的化合物顺式-3-乙烯醇、1-己醇、乙醛和顺式-3-乙烯醛含量发生变化。Davidovich-Rikanati等将罗勒(Ocimum basilicum)中的香叶醇合酶基因在番茄中表达, 改善了番茄的口感和芳香味。
1.7 雄性不育的转基因番茄
    对于自花授粉作物, 利用雄性不育系制种可以简化育种步骤, 省时省力, 而且能提高制种质量。因此, 自Mariani 等利用花粉绒毡层特异启动子启动核糖核酸酶基因在番茄中表达, 引起花粉败育,得到雄性不育的转基因番茄后, 利用雄性不育系的转基因番茄研究也有一些文献报道。Sandhu 等利用RNAi 技术将核基因Msh1 的表达抑制后, 使线粒体DNA 重排, 得到细胞质雄性不育植株; 宋洪元等利用Cre/lox 重组技术, 得到了雄性不育恢复系的番茄基因工程植株, 这些都推动了番茄雄性不育基因工程研究, 为雄性不育制种的利用及简化杂交制种技术提供了材料基础。
1.8 表达医药蛋白的转基因番茄
    利用番茄作为生物反应器生产疫苗、医药蛋白等研究正成为番茄基因工程研究的一个热点。目前主要用番茄作为生物反应器生产抗原, 从而使人体获得抗体, 另外就是直接生产有功能的医药蛋白。在抗原方面, 主要获得了含狂犬病病毒G 蛋白的转基因番茄、含有乙型肝炎病毒表面抗原基因(HBsAg)的转基因番茄、含有呼吸道合包体病毒(RSV)F 蛋白基因的转基因番茄、含Norwalk 病毒衣壳蛋白转基因番茄、可产生SARS 冠状病毒(SARS-CoV)S 蛋白特异抗体IgA 的转基因番茄及可产生抗霍乱疫苗的番茄等。在功能蛋白方面,Mor 等将人乙酰胆碱酯酶转入到番茄中, 转基因番茄果实中可检测到高量表达的乙酰胆碱酯酶活性,可用来预防和治疗有机磷引起的中毒。陈溪等利用植物偏爱密码子人工合成了人胰岛素基因, 转化番茄后, 为口服方式摄入胰岛素达到预防I 型糖尿病的成功奠定了基础。此外, 小鼠的白细胞介素IL-12 蛋白、人凝血IX 因子蛋白、α-1-抗胰蛋白酶蛋白等都在番茄中得到了成功表达。

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